【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物大分子的化學修飾領域，尤其涉及一種抗體去保護方法及其應用，進一步涉及對抗體偶聯藥物制備流程的優化，具體涉及生產抗體偶聯藥物時的減少半抗體副產物生成。
技術介紹
1、在抗體偶聯藥物的制備方法中，有一類被稱為thio-mab的抗體可以用于制備高度均一化的抗體偶聯藥物。其技術方案為：將igg1或igg4抗體上的一個或數個氨基酸替換為半胱氨酸，由于半胱氨酸具有極強的親核性，因此可以在偶聯過程中優先與連接子-藥物進行反應。如cn101835803a公開了一種半胱氨酸改造的抗tenb2抗體和抗體藥物偶聯物，用半胱氨酸替換親本抗tenb2抗體的一個或多個氨基酸，由接頭給半胱氨酸改造的抗tenb2抗體偶聯一個或多個藥物模塊以形成半胱氨酸改造的抗tenb2抗體-藥物偶聯物。
2、在實際的實驗過程中會有以下難點：由于半胱氨酸上巰基的高反應活性，往往在蛋白表達過程中，與細胞體系中游離的半胱氨酸或谷胱甘肽上相應的巰基形成二硫鍵。由于二硫鍵并不能與接頭上的反應基團連接，因此需要對抗體上新增的巰基(此時為二硫鍵狀態)進行活化，具體活化過程為：首先對抗體上的所有二硫鍵進行還原，包括抗體上原有的四對二硫鍵和額外添加的半胱氨酸所生成的二硫鍵進行還原，而后對已還原的抗體進行氧化，此時序列編輯所生成的巰基之間的空間距離一般較遠，無法生成二硫鍵，在氧化劑存在下依舊能保持活性?？贵w上原有的四對二硫鍵生成的八個巰基則會被重新被氧化為四對二硫鍵，但由于有兩對二硫鍵的空間距離較為接近，在氧化過程中存在一定比例的錯配現象發生。導致部分抗體在氧化后，
3、綜上所述，如何在thio-mab的去保護過程中降低半抗體的比例，已成為目前本領域亟待解決的問題之一。
技術實現思路
1、為解決上述技術問題，本專利技術提供了一種抗體去保護方法及其應用，本專利技術通過在成對巰基被氧化為二硫鍵前，加入金屬離子，金屬離子對已還原抗體的氧化過程形成一定的控制，從而抑制氧化過程中的鏈內錯配的發生，有效減少thio-mab及其類似抗體在制備抗體偶聯藥物的工藝過程的去保護步驟中的半抗體水平。
2、為達此目的，本專利技術采用以下技術方案：
3、第一方面，本專利技術提供了一種抗體去保護方法，所述抗體去保護方法包括：待去保護抗體通過二硫鍵與保護基團連接，將還原劑和所述待去保護抗體在緩沖溶液中混合，所述二硫鍵斷裂，除去多余的還原劑，加入金屬離子溶液，除去多余的金屬離子，加入氧化劑，獲得含有巰基的去保護抗體。
4、待去保護抗體上有至少一個游離的半胱氨酸，而半胱氨酸上巰基具有高反應活性，會在抗體表達過程中通過不可控的隨機反應與含有活潑巰基的小分子反應，例如半胱氨酸、半胱胺或谷胱甘肽等，通過二硫鍵連接，而上述含有活潑巰基的小分子相對于待去保護抗體是其保護基團。
5、本專利技術通過加入還原劑以完全還原抗體所有的鏈間二硫鍵，以及與保護基團連接的二硫鍵，二硫鍵斷裂，導致保護基團脫離抗體，形成巰基；加入金屬離子溶液，使金屬離子與抗體充分混合，金屬離子會有限地與巰基相結合；再加入氧化劑，將抗體的鏈間二硫鍵還原成的半胱氨酸殘基重新氧化為二硫鍵，金屬離子對已還原抗體的氧化過程形成一定的控制，從而抑制氧化過程中的鏈內錯配的發生。
6、對于本專利技術所適用的抗體種類，需要其具有至少一個孤立的半胱氨酸殘基，此半胱氨酸殘基的來源可以是人為的序列編輯或是天然序列中的偶然形成，且此半胱氨酸殘基既不與同序列內的半胱氨酸形成鏈內二硫鍵，也不與其他抗體片段形成鏈間二硫鍵，而是在抗體表達過程中自然或人為的與半胱氨酸或其他含有巰基的小分子形成二硫鍵。
7、具體抗體種類的選擇取決于通過抗體偶聯藥物(adc)治療的疾病或病癥(例如癌癥)?？贵w可以特異性地結合在癌細胞上表達的相應的抗原(也稱為腫瘤相關抗原(taa))、病毒抗原或微生物抗原，具有抗體依賴性細胞介導的吞噬作用(adcp)活性，并且具有體內抗腫瘤、抗病毒或抗微生物活性。抗體可以包括但不限于單克隆抗體或多克隆抗體，具體實例包括人抗體、人源化抗體或嵌合抗體。在某些實施方案中，抗體是單克隆抗體，例如人抗體或人源化抗體。實施例的結果顯示，本專利技術的生物綴合方法至少適用于igg1型抗體，此外本專利技術的生物綴合方法還可適合于igg4型抗體。
8、本專利技術所述獲得含有巰基的去保護抗體中的巰基，來源于半胱氨酸，是半胱氨酸分子所帶有的基團，由于該半胱氨酸在抗體去保護后不與其它分子形成二硫鍵，因此該半胱氨酸上的巰基孤立存在，為制備抗體偶聯藥物提供了活性位點。
9、針對本專利技術提供的除去還原劑和除去金屬離子的步驟，本領域技術人員能夠選擇適當的純化方法，例如脫鹽柱或尺寸排阻層析除去還原劑，添加大于金屬離子量的edta螯合金屬離子等。
10、優選地，所述待去保護抗體包括igg、igm、iga、ige或igd中的任意一種。
11、優選地，所述igg包括igg1、igg2、igg3或igg4中的任意一種。
12、優選地，所述待去保護抗體的濃度為0.01～0.05mm(例如可以是0.01mm、0.015mm、0.02mm、0.025mm、0.03mm、0.035mm、0.04mm、0.045mm或0.05mm等)。
13、優選地，所述保護基團包括半胱氨酸、半胱胺或谷胱甘肽中的任意一種。
14、優選地，所述去保護抗體含有至少一個巰基。
15、本專利技術所述去保護抗體若來源于天然序列中的偶然形成，則可能含有任意數量的巰基，若來源于人為的序列編輯，則僅可能含有偶數個巰基。
16、優選地，所述抗體去保護方法的反應ph為5.5～9(例如可以是5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5或9等)，優選為5.5～8(例如可以是5.5、6、6.5、7、7.5或8)。
17、優選地，所述抗體去保護方法的反應溫度為-10℃～37℃(例如可以是-10℃、-5℃、0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃或37℃等)。
18、本專利技術的最適反應條件取決于所采用的特定反應物，基于待綴合的特定抗體，本領域技術人員可以確定反應ph和溫度條件。
19、優選地，所述還原劑包括硫類還原劑和/或膦類還原劑。
20、本專利技術提供的還原劑可以是任意可以還原抗體二硫鍵的化合物，還原劑的濃度可以根據抗體的還原難易程度進行調節。
21、優選地，所述硫類還原劑包括二硫蘇糖醇(dtt)。
22、優選地，所述膦類還原劑包括三(2-羧乙基)膦(tcep)。
23、優選地，所述還原劑與所述待去保護抗體的摩爾比為(50～150)：1，優選為(90～110)：1。
24、上述(50～150)的具體點值可以選擇50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150等。...
【技術保護點】
1.一種抗體去保護方法，其特征在于，所述抗體去保護方法包括：待去保護抗體通過二硫鍵與保護基團連接，將還原劑和所述待去保護抗體在緩沖溶液中混合，所述二硫鍵斷裂，除去多余的還原劑，加入金屬離子溶液，除去多余的金屬離子，加入氧化劑，獲得含有巰基的去保護抗體。
2.根據權利要求1所述的抗體去保護方法，其特征在于，所述待去保護抗體包括IgG、IgM、IgA、IgE或IgD中的任意一種；
3.根據權利要求1或2所述的抗體去保護方法，其特征在于，所述抗體去保護方法的反應pH為5.5～9，優選為5.5～8；
4.根據權利要求1～3任一項所述的抗體去保護方法，其特征在于，所述還原劑包括硫類還原劑和/或膦類還原劑；
5.根據權利要求1～4任一項所述的抗體去保護方法，其特征在于，所述金屬離子溶液中的金屬包括第一到第三過渡系、第二到第五主族中的金屬元素；
6.根據權利要求1～5任一項所述的抗體去保護方法，其特征在于，所述氧化劑包括脫氫抗壞血酸、5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)或氧氣中的任意一種或至少兩種的組合；
7.根據權利要求
8.如權利要求1～7任一項所述的抗體去保護方法在抗體偶聯藥物制備過程中減少半抗體生成中的應用。
9.一種抗體偶聯藥物的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括：使用權利要求1～7任一項所述的抗體去保護方法制備獲得含有巰基的去保護抗體，與接頭和藥物混合，獲得所述抗體偶聯藥物。
10.根據權利要求9所述的制備方法，其特征在于，所述接頭含有至少兩個反應性基團，所述反應性基團包括第一反應性基團和第二反應性基團，所述第一反應性基團具有共價結合巰基的能力，所述第二反應性基團具有共價結合藥物的能力；
...【技術特征摘要】
1.一種抗體去保護方法，其特征在于，所述抗體去保護方法包括：待去保護抗體通過二硫鍵與保護基團連接，將還原劑和所述待去保護抗體在緩沖溶液中混合，所述二硫鍵斷裂，除去多余的還原劑，加入金屬離子溶液，除去多余的金屬離子，加入氧化劑，獲得含有巰基的去保護抗體。
2.根據權利要求1所述的抗體去保護方法，其特征在于，所述待去保護抗體包括igg、igm、iga、ige或igd中的任意一種；
3.根據權利要求1或2所述的抗體去保護方法，其特征在于，所述抗體去保護方法的反應ph為5.5～9，優選為5.5～8；
4.根據權利要求1～3任一項所述的抗體去保護方法，其特征在于，所述還原劑包括硫類還原劑和/或膦類還原劑；
5.根據權利要求1～4任一項所述的抗體去保護方法，其特征在于，所述金屬離子溶液中的金屬包括第一到第三過渡系、第二到第五主族中的金屬元素；
6.根據權利要求1～5任一項所述的抗體去保護方法，其特征在于，所述氧化劑包括脫氫抗壞血酸、5,5...
【專利技術屬性】
技術研發人員：原玉潔，王澤坤，范啟睿，
申請(專利權)人：上海藥明合聯生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：
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