【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及病毒檢測，尤其涉及用于檢測牛結節性皮膚病病毒的nanopcr引物、試劑盒和檢測方法。
技術介紹
1、牛結節性皮膚病(lumpy?skindisease，lsd)，別名牛結節性皮炎、結節皮膚病(knopvelsiekte)、牛疙瘩皮膚病、牛結節疹或傳染性皮膚潰爛癥，由牛結節性皮膚病病毒(lumpy?skindisease?virus,lsdv)引起，以發熱，皮膚、可視黏膜及內臟器官廣泛分布結節腫塊或潰爛等臨床癥狀為特征，是一種牛的急性、病毒性傳染病。在疾病的自然暴發中，lsd潛伏期大約28天，發病率3～85％不等，死亡率一般在1％～5％之間。感染初期，患病牛一般會出現發熱(40℃以上)、精神抑郁、厭食等：大多數患病牛在發熱48h左右后，它們的皮膚上尤其是在頭部、頸部、四肢、乳房、生殖器和會陰等部位形成多個邊界清楚、圓形堅硬的結節(直徑大約為2.5cm)，累及皮膚、皮下組織，有時甚至累及皮下肌肉。小結節可自行分解而不留下明顯的疤痕，而大結節可能壞死并最終纖維化，形成壞疽而留下永久性疤痕。一些患病牛還會因為潰瘍性病變出現在眼睛、口腔、鼻腔部位，表現出流涎、流眼淚、流鼻涕等，精神抑郁、厭食和消瘦也是一些患病牛的癥狀；有些病牛因四肢和身體的其他腹側部分，如垂肉、胸、陰囊和陰戶出現水腫，活動量減少甚至不愿活動，二次感染的患病牛還會會因滑膜炎、腱鞘炎導致行動不便和不能站立，嚴重的甚至死亡。
2、牛結節性皮膚病己造成養牛業經濟損失并影響牛及其動物產品的正常國際貿易，是世界動物衛生組織(oie)必須通報的動物疫病之一，也
3、目前檢測牛結節性皮膚病病毒的方法為常規凝膠pcr法，用于檢測血液，精液和組織培養樣品中的牛結節性皮膚病病毒基因組。但常規pcr靈敏度較低，如果樣本中病毒含量較低，會造成錯檢和漏檢的情況發生。因此，高靈敏度的lsdv檢測試劑對于牛結節性皮膚病病毒的檢測成為了亟需。
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于提供用于檢測牛結節性皮膚病病毒的nano?pcr引物、試劑盒和檢測方法，解決普通pcr檢測牛結節性皮膚病病毒，檢出率低的問題。
2、為了實現上述專利技術目的，本專利技術提供以下技術方案：
3、本專利技術提供了用于檢測牛結節性皮膚病病毒的nano?pcr引物，包括上游引物p32-f和下游引物p32-r，所述上游引物p32-f的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，所述下游引物p32-r的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。
4、本專利技術還提供了所述的nano?pcr引物在檢測牛結節性皮膚病病毒中的應用，所述檢測為非疾病檢測目的。
5、本專利技術還提供了所述的nano?pcr引物在制備檢測牛結節性皮膚病病毒的試劑盒中的應用。
6、本專利技術還提供了用于檢測牛結節性皮膚病病毒的試劑盒，包括所述的nano?pcr引物。
7、本專利技術還提供了一種牛結節性皮膚病病毒的檢測方法，包括如下步驟：
8、(1)提取待測樣品中的病毒dna；
9、(2)以提取的病毒dna為模板，用所述的nano?pcr引物進行nano?pcr擴增，如果能擴增出陽性擴增曲線，可以確定樣品中含有牛結節性皮膚病病毒；
10、所述檢測為非疾病診斷目的。
11、優選的，所述nano?pcr擴增的反應體系為12.5μl?2×premix?taq、20ng?dna模板、0.5μm上游引物、0.5μm下游引物、0.6mm納米金顆粒。
12、優選的，所述nano?pcr擴增的反應條件為：預變性95℃5min，35個循環的變性95℃30s、退火58℃30s、延伸72℃1min，終延伸72℃10min，4℃保存。
13、通過采用上述技術方案，本專利技術具有如下有益效果：本專利技術設計合成了用于檢測牛結節性皮膚病病毒的引物并建立了檢測方法，本專利技術提供的引物及檢測方法靈敏度高，檢出限為30copies/μl，避免了漏檢的可能，特異性強，對有效檢測牛結節性皮膚病病毒及牛結節性皮膚病的防控提供了技術支持。
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1.用于檢測牛結節性皮膚病病毒的Nano?PCR引物，其特征在于，包括上游引物P32-F和下游引物P32-R，所述上游引物P32-F的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，所述下游引物P32-R的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。
2.權利要求1所述的Nano?PCR引物在檢測牛結節性皮膚病病毒中的應用，所述檢測為非疾病檢測目的。
3.權利要求1所述的Nano?PCR引物在制備檢測牛結節性皮膚病病毒的試劑盒中的應用。
4.用于檢測牛結節性皮膚病病毒的試劑盒，其特征在于，包括權利要求1所述的引物。
5.一種牛結節性皮膚病病毒的檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：
6.根據權利要求5所述的檢測方法，其特征在于，所述Nano?PCR擴增的反應體系為12.5μL?2×Premix?Taq、20ng?DNA模板、0.5μM上游引物、0.5μM下游引物、0.6mM納米金顆粒。
7.根據權利要求6所述的檢測方法，其特征在于，所述Nano?PCR擴增的反應條件為：預變性95℃5min，35個循環的變性95℃30s、退
...【技術特征摘要】
1.用于檢測牛結節性皮膚病病毒的nano?pcr引物，其特征在于，包括上游引物p32-f和下游引物p32-r，所述上游引物p32-f的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，所述下游引物p32-r的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。
2.權利要求1所述的nano?pcr引物在檢測牛結節性皮膚病病毒中的應用，所述檢測為非疾病檢測目的。
3.權利要求1所述的nano?pcr引物在制備檢測牛結節性皮膚病病毒的試劑盒中的應用。
4.用于檢測牛結節性皮膚病病毒的試劑盒，其特征在于，包括權利要求1...
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