【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本申請(qǐng)屬于免疫細(xì)胞培養(yǎng)，具體涉及一種培養(yǎng)長(zhǎng)壽型inkt細(xì)胞的培養(yǎng)基及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、自然殺傷t細(xì)胞(natural?killer?t?cell，nkt)是一類(lèi)同時(shí)表達(dá)t細(xì)胞受體和nk細(xì)胞受體的淋巴細(xì)胞亞群，兼具有t細(xì)胞和nk細(xì)胞雙重特征，參與抗腫瘤、自身免疫性疾病的發(fā)病、變態(tài)反應(yīng)的調(diào)節(jié)和抑制寄生蟲(chóng)感染等多種免疫反應(yīng)，在固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中均發(fā)揮重要作用(annu.rev.immunol.25.1(2007):297-336.)。nkt細(xì)胞主要分為三個(gè)亞型：i型nkt細(xì)胞(即inkt細(xì)胞)，表達(dá)恒定tcr鏈，識(shí)別cd1d分子提呈的脂類(lèi)抗原，主要發(fā)揮抗腫瘤和抗感染作用；ii型nkt細(xì)胞，與免疫抑制相關(guān)；iii型nkt細(xì)胞，既不依賴cd1d分子識(shí)別抗原，也對(duì)脂類(lèi)抗原無(wú)反應(yīng)，其特征和功能尚未明確。
2、inkt細(xì)胞靶向治療，因其強(qiáng)大而廣譜的抗腫瘤活性，優(yōu)越的安全性和異體通用潛力，被認(rèn)為是治療和預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的最理想治療方法(current?opinion?inimmunology?20.3(2008):358-368.)：(1)inkt細(xì)胞可直接溶解表達(dá)cd1d的腫瘤細(xì)胞，其快速釋放的腫瘤殺傷性因子量遠(yuǎn)高于nk細(xì)胞和t細(xì)胞；(2)inkt細(xì)胞分泌大量的促炎因子可間接廣泛激活dc細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、nk細(xì)胞、t細(xì)胞和b細(xì)胞等，并招募和誘導(dǎo)這些細(xì)胞進(jìn)行抗腫瘤作用；(3)inkt細(xì)胞活化后可裂解表達(dá)cd1d的tam/mdsc，將促腫瘤的m2重新編程為抗腫瘤的m1，減少ii型nkt細(xì)胞數(shù)量，逆轉(zhuǎn)處于耗竭狀態(tài)的t細(xì)胞和nk
3、在相關(guān)技術(shù)中，如哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院報(bào)道了通過(guò)磁珠分離及il-2和cd3單抗擴(kuò)增外周血單個(gè)核細(xì)胞中自體inkt細(xì)胞的方法(clinical?cancer?research?23.14(2017):3510-3519.)；cancer?research上最新報(bào)道了通過(guò)α-galcer(α-半乳糖神經(jīng)酰胺)及il-2對(duì)inkt進(jìn)行體外擴(kuò)增的方法(cancer?research?83.4(2023):582-594.)。然而，現(xiàn)有的inkt培養(yǎng)方案依然存在明顯不足，嚴(yán)重限制了其在臨床抗腫瘤治療中的有效應(yīng)用，具體表現(xiàn)在：
4、(1)inkt細(xì)胞數(shù)量少，在健康人外周血中約占t細(xì)胞的0.1～1％，體外篩選、擴(kuò)增、培養(yǎng)十分困難，需要高成本的設(shè)備和經(jīng)驗(yàn)豐富的操作者；
5、(2)inkt細(xì)胞在傳統(tǒng)培養(yǎng)過(guò)程中獲得耗竭和衰老表型，如pd-1、tim-3表達(dá)升高，細(xì)胞進(jìn)入體內(nèi)迅速發(fā)生凋亡，作用持續(xù)時(shí)間短。
6、因此，亟需研發(fā)新的inkt培養(yǎng)方案，以有效大量擴(kuò)增并激活inkt細(xì)胞，且持久的增強(qiáng)inkt細(xì)胞的抗腫瘤活性，從而真正發(fā)揮出inkt細(xì)胞巨大的臨床應(yīng)用潛力，為inkt臨床治療惡性實(shí)體瘤開(kāi)辟新的途徑。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、1.要解決的問(wèn)題
2、本申請(qǐng)針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中inkt細(xì)胞體外培養(yǎng)過(guò)程中存在的擴(kuò)增困難、inkt純度低、培養(yǎng)后的inkt作用持續(xù)時(shí)間短等局限之一，提供一種新型培養(yǎng)長(zhǎng)壽型inkt細(xì)胞的培養(yǎng)基及其應(yīng)用，該培養(yǎng)基包括添加劑il-2、il-7、il-15、α-galcer、維生素c、谷氨酰胺和tws119；將其用于inkt細(xì)胞的培養(yǎng)，可以使用外周血或臍帶血分離出的單個(gè)核細(xì)胞作為來(lái)源，體外擴(kuò)增和優(yōu)化培養(yǎng)后，無(wú)需磁珠富集即可獲得大量高純度長(zhǎng)壽型inkt細(xì)胞，細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，抗腫瘤作用強(qiáng)，為基于nkt/inkt細(xì)胞免疫治療的廣泛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
3、2.技術(shù)方案
4、為了解決上述問(wèn)題，本申請(qǐng)所采用的技術(shù)方案如下：
5、本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N培養(yǎng)長(zhǎng)壽型inkt細(xì)胞的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基包括：gt-t551?h3完全培養(yǎng)基，還包括添加劑：人白介素2(il-2)、人白介素7(il-7)、人白介素15(il-15)、α-半乳糖神經(jīng)酰胺(α-galcer)、谷氨酰胺、tws119和維生素c，其中：il-2、il-7和il-15用于擴(kuò)增inkt細(xì)胞；α-半乳糖神經(jīng)酰胺(α-galcer)用于激活inkt細(xì)胞；谷氨酰胺是維持inkt擴(kuò)增及其功能的重要添加劑；tws119用于抑制inkt過(guò)度分化及其耗竭的發(fā)生，延長(zhǎng)細(xì)胞壽命；維生素c為還原劑，用于清除細(xì)胞代謝過(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)氧化物自由基，防止過(guò)氧化物自由基堆積過(guò)多誘導(dǎo)inkt細(xì)胞衰老和凋亡。
6、進(jìn)一步地，上述一種培養(yǎng)長(zhǎng)壽型inkt細(xì)胞的培養(yǎng)基，其中各添加劑的濃度為：
7、人白介素2(il-2)，100～200u/ml；
8、人白介素7(il-7)，20～40ng/ml；
9、人白介素15(il-15)，20～40ng/ml；
10、α-半乳糖神經(jīng)酰胺(α-galcer)，50～100ng/ml；
11、谷氨酰胺，0.1～3mm；
12、tws119，1～3μm；
13、維生素c，20～50μg/ml。
14、進(jìn)一步地，上述一種培養(yǎng)長(zhǎng)壽型inkt細(xì)胞的培養(yǎng)基中，谷氨酰胺的濃度為0.3～3mm。
15、進(jìn)一步地，上述一種培養(yǎng)長(zhǎng)壽型inkt細(xì)胞的培養(yǎng)基中，谷氨酰胺的濃度為1～3mm。
16、進(jìn)一步地，上述一種培養(yǎng)長(zhǎng)壽型inkt細(xì)胞的培養(yǎng)基中，谷氨酰胺的濃度為1mm、2mm或3mm。
17、進(jìn)一步地，上述一種培養(yǎng)長(zhǎng)壽型inkt細(xì)胞的培養(yǎng)基中，tws119的濃度為2～3μm。
18、進(jìn)一步地，上述一種培養(yǎng)長(zhǎng)壽型inkt細(xì)胞的培養(yǎng)基中，tws119的濃度為2μm或3μm。
19、進(jìn)一步地，上述一種培養(yǎng)長(zhǎng)壽型inkt細(xì)胞的培養(yǎng)基，其中各添加劑的濃度為：
20、人白介素2(il-2)，100u/ml；
21、人白介素7(il-7)，40ng/ml；
22、人白介素15(il-15)，40ng/ml；
23、α-半乳糖神經(jīng)酰胺(α-galcer)，100ng/ml；
24、谷氨酰胺，1mm；
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【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種培養(yǎng)長(zhǎng)壽型iNKT細(xì)胞的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基包括：完全培養(yǎng)基和添加劑，所述添加劑包括：人白介素2、人白介素7、人白介素15、α-半乳糖神經(jīng)酰胺、谷氨酰胺、TWS119和維生素C。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種培養(yǎng)長(zhǎng)壽型iNKT細(xì)胞的培養(yǎng)基，其特征在于，
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種培養(yǎng)長(zhǎng)壽型iNKT細(xì)胞的培養(yǎng)基，其特征在于，所述谷氨酰胺的濃度為0.3～3mM；和/或所述TWS119的濃度為2～3μM。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種培養(yǎng)長(zhǎng)壽型iNKT細(xì)胞的培養(yǎng)基，其特征在于，所述谷氨酰胺的濃度為1～3mM。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的一種培養(yǎng)長(zhǎng)壽型iNKT細(xì)胞的培養(yǎng)基，其特征在于，所述完全培養(yǎng)基為GT-T551?H3完全培養(yǎng)基，包括：GT-T551?H3無(wú)血清培養(yǎng)基，2～3％滅活血漿，100U/mL青霉素，100μg/mL鏈霉素。
6.權(quán)利要求1-5任一所述的一種培養(yǎng)長(zhǎng)壽型iNKT細(xì)胞的培養(yǎng)基在制備長(zhǎng)壽型iNKT細(xì)胞中的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用是以外周血或臍帶血分離出的單個(gè)核細(xì)胞作為來(lái)源，經(jīng)初始培
7.一種培養(yǎng)長(zhǎng)壽型iNKT細(xì)胞的方法，其特征在于，所述方法包括：以外周血或臍帶血分離出的單個(gè)核細(xì)胞作為來(lái)源，經(jīng)初始培養(yǎng)和擴(kuò)增培養(yǎng)后，收集獲得長(zhǎng)壽型iNKT細(xì)胞；其中：
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用或權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述補(bǔ)充培養(yǎng)長(zhǎng)壽型iNKT細(xì)胞的培養(yǎng)基包括：按照1:1的體積補(bǔ)充培養(yǎng)長(zhǎng)壽型iNKT細(xì)胞的培養(yǎng)基。
9.權(quán)利要求7或8所述的一種培養(yǎng)長(zhǎng)壽型iNKT細(xì)胞的方法培養(yǎng)的長(zhǎng)壽型iNKT細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的長(zhǎng)壽型iNKT細(xì)胞，其特征在于，所述長(zhǎng)壽型iNKT細(xì)胞，具有高表達(dá)的長(zhǎng)壽標(biāo)志物CD62L，以及下調(diào)表達(dá)耗竭標(biāo)志物PD-1及TIM-3。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種培養(yǎng)長(zhǎng)壽型inkt細(xì)胞的培養(yǎng)基，其特征在于，所述培養(yǎng)基包括：完全培養(yǎng)基和添加劑，所述添加劑包括：人白介素2、人白介素7、人白介素15、α-半乳糖神經(jīng)酰胺、谷氨酰胺、tws119和維生素c。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種培養(yǎng)長(zhǎng)壽型inkt細(xì)胞的培養(yǎng)基，其特征在于，
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種培養(yǎng)長(zhǎng)壽型inkt細(xì)胞的培養(yǎng)基，其特征在于，所述谷氨酰胺的濃度為0.3～3mm；和/或所述tws119的濃度為2～3μm。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種培養(yǎng)長(zhǎng)壽型inkt細(xì)胞的培養(yǎng)基，其特征在于，所述谷氨酰胺的濃度為1～3mm。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的一種培養(yǎng)長(zhǎng)壽型inkt細(xì)胞的培養(yǎng)基，其特征在于，所述完全培養(yǎng)基為gt-t551?h3完全培養(yǎng)基，包括：gt-t551?h3無(wú)血清培養(yǎng)基，2～3％滅活血漿，100u/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素。
6.權(quán)利要...
【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：莫南德·阿德維希，吳強(qiáng)生，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：醫(yī)拓醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室南京有限公司，
類(lèi)型：發(fā)明
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