【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及蛋白質表達與合成。更具體地，本專利技術涉及一種無細胞蛋白表達系統。本專利技術還涉及用于無細胞蛋白表達的試劑盒和方法。
技術介紹
1、蛋白質作為潛在的治療性生物制劑、藥物靶標和生物催化劑，具有重要的科學和實際意義?，F有技術已實現了眾多蛋白的成功表達和生產，然而許多具有重要意義的蛋白由于各種原因仍難以有效表達，比如細胞毒性蛋白、難溶蛋白等。隨著科學技術的發展，無細胞蛋白表達技術因其獨特的開放體系特點，允許控制反應條件、反應物的組分、直接監控反應表達等優點，成為了一種強有力的蛋白表達方法。無細胞蛋白質合成(cell-freeprotein?synthesis，cfps)系統是以外源dna或mrna為模板，人工添加所需原料和能源物質，以細胞提取物為條件合成蛋白的體外基因表達系統，可以突破細胞限制，方便快捷地表達各種蛋白質。詳言之，cfps是以dna為模板，在rna聚合酶及轉錄因子等組分作用下，轉錄出相應的mrna；以mrna為模板，利用系統中的核糖體、氨基酸底物、trna、能源物質等翻譯合成蛋白質。無細胞蛋白表達無需維持細胞代謝，更加高效；因其獨特的開放體系特點，允許控制反應條件、反應物的組分、直接監控反應表達等優點，具有表達各種毒性蛋白和難表達蛋白的潛力。
2、然而，傳統的無細胞蛋白合成有效率低和成本高等問題。為了解決無細胞蛋白合成成本高的問題，2005年，kara?a.calhoun和james?r.swartz利用葡萄糖作為能源替代價格高昂的磷酸烯醇丙酮酸進行批次式無細胞蛋白的表達，成本可降低75％。雖然
技術實現思路
1、針對上述問題，本專利技術提出了一種高效低廉的無細胞蛋白表達方法。本申請的專利技術人意外地發現，通過向無細胞體系中加入高水平的將l-谷氨酸轉化成α-酮戊二酸的酶，能夠加速三羧酸循環和氧化磷酸化反應，為cpfs提供更多的能量，進而提高蛋白的表達量，降低反應成本。
2、在一個方面，本專利技術提供一種無細胞蛋白表達系統，包括編碼目標蛋白的核酸、細胞提取物和補充體系，所述補充體系包括核苷酸混合物、氨基酸混合物、緩沖液、鎂鹽、鉀鹽、l-谷氨酸鹽以及草酸鹽，其中所述表達系統含有外源的將l-谷氨酸轉化成α-酮戊二酸的酶。
3、在一些實施方式中，所述將l-谷氨酸轉化成α-酮戊二酸的酶為谷氨酸脫氫酶(gdh)、氨基酸氧化酶(laao)和谷氨酸氧化酶(lgox)中的一種或多種。在優選的實施方式中，所述將l-谷氨酸轉化成α-酮戊二酸的酶為谷氨酸脫氫酶(gdh)或谷氨酸氧化酶(lgox)。在更優選的實施方式中，所述將l-谷氨酸轉化成α-酮戊二酸的酶為谷氨酸脫氫酶。
4、在一些實施方式中，所述谷氨酸脫氫酶來源于大腸桿菌，基因序列為seq?id?no:1或其等效物。
5、在一些實施方式中，所述外源的將l-谷氨酸轉化成α-酮戊二酸的酶的濃度不低于約75u/ml。
6、在一些實施方式中，所述外源的將l-谷氨酸轉化成α-酮戊二酸的酶來自：該酶的添加；將編碼該酶的基因轉化作為所述細胞提取物的來源的細胞；和/或將編碼該酶的基因敲入作為所述細胞提取物的來源的細胞。
7、在一些實施方式中，所述表達系統還含有硫胺素。
8、在一些實施方式中，所述硫胺素的濃度為約0.007-約0.7mg/ml。
9、在另一方面，本專利技術提供一種用于無細胞蛋白表達的試劑盒，包括細胞提取物和補充體系，所述補充體系包括核苷酸混合物、氨基酸混合物、緩沖液、鎂鹽、鉀鹽、l-谷氨酸鹽以及草酸鹽，其中所述試劑盒含有外源的將l-谷氨酸轉化成α-酮戊二酸的酶。
10、在又一方面，本專利技術提供一種表達目標蛋白的方法，包括：在上述無細胞蛋白表達系統中，在適于表達目標蛋白的條件下，使編碼目標蛋白的核酸、細胞提取物和補充體系混合，從而表達目標蛋白。
11、本專利技術的其他方面和優點將在具體實施方式中詳細描述，本領域技術人員能夠從下文的具體描述中意識到未在本公開中明確表述的其他方面和優點。
本文檔來自技高網...【技術保護點】
1.一種無細胞蛋白表達系統，包括編碼目標蛋白的核酸、細胞提取物和補充體系，所述補充體系包括核苷酸混合物、氨基酸混合物、緩沖液、鎂鹽、鉀鹽、L-谷氨酸鹽以及草酸鹽，其中所述表達系統含有外源的將L-谷氨酸轉化成α-酮戊二酸的酶。
2.根據權利要求1所述的系統，其中所述將L-谷氨酸轉化成α-酮戊二酸的酶為谷氨酸脫氫酶、氨基酸氧化酶和谷氨酸氧化酶中的一種或多種。
3.根據權利要求1所述的系統，其中所述將L-谷氨酸轉化成α-酮戊二酸的酶為谷氨酸脫氫酶。
4.根據權利要求3所述的系統，其中所述谷氨酸脫氫酶來源于大腸桿菌，基因序列為SEQ?ID?NO:?1。
5.根據權利要求1至4中任一項所述的系統，其中所述外源的將L-谷氨酸轉化成α-酮戊二酸的酶的濃度不低于75U/mL。
6.根據權利要求1至4中任一項所述的系統，其中所述外源的將L-谷氨酸轉化成α-酮戊二酸的酶來自：該酶的添加；將編碼該酶的基因轉化作為所述細胞提取物的來源的細胞；和/或將編碼該酶的基因敲入作為所述細胞提取物的來源的細胞。
7.根據權利要求1所述的系統，其
8.根據權利要求7所述的系統，其中所述硫胺素的濃度為0.007-0.7mg/mL。
9.一種用于無細胞蛋白表達的試劑盒，包括細胞提取物和補充體系，所述補充體系包括核苷酸混合物、氨基酸混合物、緩沖液、鎂鹽、鉀鹽、L-谷氨酸鹽以及草酸鹽，其中所述試劑盒含有外源的將L-谷氨酸轉化成α-酮戊二酸的酶。
10.一種表達目標蛋白的方法，包括：在權利要求1至8中任一項所述的系統中，在適于表達目標蛋白的條件下，使編碼目標蛋白的核酸、細胞提取物和補充體系混合，從而表達目標蛋白。
...【技術特征摘要】
1.一種無細胞蛋白表達系統，包括編碼目標蛋白的核酸、細胞提取物和補充體系，所述補充體系包括核苷酸混合物、氨基酸混合物、緩沖液、鎂鹽、鉀鹽、l-谷氨酸鹽以及草酸鹽，其中所述表達系統含有外源的將l-谷氨酸轉化成α-酮戊二酸的酶。
2.根據權利要求1所述的系統，其中所述將l-谷氨酸轉化成α-酮戊二酸的酶為谷氨酸脫氫酶、氨基酸氧化酶和谷氨酸氧化酶中的一種或多種。
3.根據權利要求1所述的系統，其中所述將l-谷氨酸轉化成α-酮戊二酸的酶為谷氨酸脫氫酶。
4.根據權利要求3所述的系統，其中所述谷氨酸脫氫酶來源于大腸桿菌，基因序列為seq?id?no:?1。
5.根據權利要求1至4中任一項所述的系統，其中所述外源的將l-谷氨酸轉化成α-酮戊二酸的酶的濃度不低于75u/ml。
6.根據權利要求1至4中任一項所...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王丹丹，楊修竹，崔金輝，甘明哲，
申請(專利權)人：蘇州珀羅汀生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：
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