【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于電化學生物傳感器制備和乳制品病原菌檢測，具體涉及基于rpa-crispr的mwcnts-au電化學生物傳感器及其制備方法和應用。
技術介紹
1、乳制品營養豐富，富含鈣質，可提供高質量蛋白質，但也是微生物生長繁殖的溫床。在生產加工過程中，食源性致病菌等微生物污染會加速乳制品的變質，影響其貨架期和貯藏穩定性。金黃色葡萄球菌是常見的食源性致病菌之一，其可在乳制品中生長，并產生耐熱性毒素，導致食物中毒。因此，需要建立一種超特異性、高靈敏度、準確的金黃色葡萄球菌分析方法，通過采取早期干預措施迅速追溯源頭，然后實施應急響應來避免大規模污染事件，這對于保障消費者健康具有重要意義。
2、目前，金黃色葡萄球菌等食源性致病菌的檢測方法主要包括平板涂布法、pcr等分子生物學方法以及elisa等免疫分析法和電化學方法。盡管大多方法如平板涂布法、pcr和elisa有著檢測靈敏等優點，但是存在檢測流程繁瑣耗時、檢測成本較高、難以實現檢測設備小型化等不足，這限制了起在實際檢測中的應用。相比之下，電化學方法因其靈敏度高、快速性和便攜性，在金黃色葡萄球菌等食源性致病菌的檢測中具有顯著的優越性，尤其是在需要快速響應的食品安全監測場合。隨著傳感器的發展，對金黃色葡萄球菌檢測的線性范圍越來越大，檢測限越來越低，但檢測的特異性和穩定性仍然較低，制約了傳感器的發展。因此，需要開發一種靈敏度高、特異性好、穩定性強的傳感器來用于檢測金黃色葡萄球菌等食源性致病菌。
技術實現思路
1、針對現有技術中存在的一
2、為了實現上述技術目的，本專利技術采用以下技術手段：
3、本專利技術首先提供了一種基于rpa-crispr的mwcnts-au電化學生物傳感器，所述電化學生物傳感器包括多壁碳納米管-納米金-發卡核苷酸探針修飾絲網印刷碳電極和crispr-crrna-target?dna三元復合物；所述crispr-crrna-target?dna三元復合物組裝在多壁碳納米管-納米金-發卡核苷酸探針修飾絲網印刷碳電極表面；
4、所述多壁碳納米管-納米金-發卡核苷酸探針中，增敏材料多壁碳納米管與固定支撐物納米金組裝，發卡核苷酸hpdna5’端修飾巰基、3’端修飾亞甲基藍(mb)并通過au-s鍵固定在其中。
5、優選地，所述hpdna的序列為hs-sh?c6-tgcttgccaagctgtatgcttttctcttttgcattgtagttttcttttt-mb；
6、所述crispr-crrna-target?dna三元復合物由crispr/cas12a、crrna和targetdna復合得到，所述crrna的序列為uaauuucuacuaaguguagauguugaaguugcacuauauac(seq?idno.1)；
7、所述target?dna的序列為gcatcacaaacagataatggcgtaaatagaagtggttctgaagatccaacagtatatagtgcaacttcaactaaaaaattacataaagaacctgcgacattaattaaagcgattgatggtgatacggttaaattaatgt(seq?id?no.2)。
8、本專利技術還提供了上述mwcnts-au電化學生物傳感器的制備方法，所述制備方法包括：
9、(1)多壁碳納米管-納米金-發卡核苷酸探針修飾絲網印刷碳電極的制備：
10、將mwcnts材料于純水中超聲分散，滴涂在絲網印刷碳電極spce表面，干燥得多壁碳納米管材料修飾絲網印刷碳電極，記為mwcnts/spce；
11、然后用含有四氯金酸haucl4·4h2o的聚合液在mwcnts/spce表面電聚合，得到納米金-多壁碳納米管材料修飾絲網印刷碳電極，記為mwcnts-au/spce；
12、接著將hpdna滴加在mwcnts-au/spce表面，孵育后用pbs洗滌多次，然后滴加巰基乙醇(mch)，洗滌，干燥，得到發卡核苷酸-納米金-多壁碳納米管修飾絲網印刷碳電極，記為hpdna-mwcnts-au/spce；
13、(2)基于rpa-crispr/cas12a的mwcnts-au新型電化學生物傳感器的制備：
14、將crispr/cas12a、crrna、10×ne緩沖液2.1、無酶水和金黃色葡萄球菌的靶核酸(target?dna)混合并進行自主裝，得到crispr-crrna-target?dna三元復合物；
15、將crispr-crrna-target?dna三元復合物滴加在hpdna-mwcnts-au/spce電極表面并進行反應，反應結束后沖洗電極，得到所述基于rpa-crispr/cas12a的mwcnts-au新型電化學生物傳感器。
16、優選地，步驟(1)中，mwcnts/spce制備時，所述mwcnts和純水的用量比為0.5mg:1ml，滴涂用量為10μl。
17、優選地，步驟(1)中，mwcnts-au/spce制備時，所述聚合液的用量為10ml，聚合液中haucl4·4h2o的濃度為2mm，所述電聚合的條件為電壓為-0.2v，電聚合時間為60s。
18、優選地，步驟(1)中，hpdna-mwcnts-au/spce制備時，所述hpdna的濃度為2μm，用量為8μl；
19、所述孵育的條件為在4℃下孵育過夜；所述pbs的濃度為10mm，ph為7.2，每次用量為100μl；
20、所述hpdna滴加前激活處理，步驟為：用三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(tcep)將hpdna巰基避光激活，激活后溶于te緩沖液中。
21、優選地，步驟(2)中，所述crispr/cas12a、crrna、10×ne緩沖液2.1、無酶水和金黃色葡萄球菌的靶核酸的用量為1μl：2μl：3μl：21μl：3μl；
22、所述crispr/cas12a的濃度為1μm；所述crrna的濃度為1μm。
23、優選地，步驟(2)中，所述crrna的序列為uaauuucuacuaaguguagauguugaaguugcacuauaua本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種基于RPA-CRISPR的MWCNTs-Au電化學生物傳感器，其特征在于，所述電化學生物傳感器包括多壁碳納米管-納米金-發卡核苷酸探針修飾絲網印刷碳電極和CRISPR-crRNA-Target?DNA三元復合物；所述CRISPR-crRNA-Target?DNA三元復合物組裝在多壁碳納米管-納米金-發卡核苷酸探針修飾絲網印刷碳電極表面；
2.根據權利要求1所述的MWCNTs-Au電化學生物傳感器，其特征在于，所述hpDNA的序列為HS-SH?C6-TGCTTGCCAAGCTGTATGCTTTTCTCTTTTGCATTGTAGTTTTCTTTTT-MB；
3.權利要求1所述的MWCNTs-Au電化學生物傳感器的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括：
4.根據權利要求3所述的MWCNTs-Au電化學生物傳感器的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，MWCNTs/SPCE制備時，所述MWCNTs和純水的用量比為0.5mg:1mL，滴涂用量為10μL。
5.根據權利要求3所述的MWCNTs-Au電化學生物傳感器的制備方法，其特征在于
6.根據權利要求3所述的MWCNTs-Au電化學生物傳感器的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，hpDNA-MWCNTs-Au/SPCE制備時，所述hpDNA的濃度為2μM，用量為8μL；
7.根據權利要求3所述的MWCNTs-Au電化學生物傳感器的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述CRISPR/Cas12a、crRNA、10×NE緩沖液2.1、無酶水和金黃色葡萄球菌的靶核酸的用量為1μL：2μL：3μL：21μL：3μL；
8.根據權利要求3所述的MWCNTs-Au電化學生物傳感器的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述自主裝為在37℃自組裝10min；
9.權利要求1所述的MWCNTs-Au電化學生物傳感器在檢測金黃色葡萄球菌中的應用。
10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于，所述應用為檢測乳制品中的金黃色葡萄球菌。
...【技術特征摘要】
1.一種基于rpa-crispr的mwcnts-au電化學生物傳感器，其特征在于，所述電化學生物傳感器包括多壁碳納米管-納米金-發卡核苷酸探針修飾絲網印刷碳電極和crispr-crrna-target?dna三元復合物；所述crispr-crrna-target?dna三元復合物組裝在多壁碳納米管-納米金-發卡核苷酸探針修飾絲網印刷碳電極表面；
2.根據權利要求1所述的mwcnts-au電化學生物傳感器，其特征在于，所述hpdna的序列為hs-sh?c6-tgcttgccaagctgtatgcttttctcttttgcattgtagttttcttttt-mb；
3.權利要求1所述的mwcnts-au電化學生物傳感器的制備方法，其特征在于，所述制備方法包括：
4.根據權利要求3所述的mwcnts-au電化學生物傳感器的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，mwcnts/spce制備時，所述mwcnts和純水的用量比為0.5mg:1ml，滴涂用量為10μl。
5.根據權利要求3所述的mwcnts-au電化學生物傳感器的制備方法，其特征...
【專利技術屬性】
技術研發人員：孫宗保，郭藝清，李晨，郭王，張新愛，鄒小波，
申請(專利權)人：江蘇大學，
類型：發明
國別省市：
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