【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種mrna疫苗組合物及其應用，特別涉及一種高致病性prrsvmrna疫苗組合物及其應用。本專利技術屬于生物醫藥。
技術介紹
1、豬繁殖與呼吸綜合征(porcine?reproductive?andrespiratory?syndrome，prrs)于20世紀80年代首次在北美出現，隨后傳播到歐洲。從那時起，這種疾病就在世界范圍內蔓延，并演變成養豬業中最具破壞性的疾病之一，以生殖衰竭和呼吸道疾病為主要特征。prrs病毒(porcine?reproductive?andrespiratory?syndrome?virus，prrsv)是一種單股正鏈，有囊膜的rna病毒，屬于動脈炎病毒科套式病毒目，全長基因組約為15kb。其基因組包含至少10個開放閱讀框(orf)，orf1a和orf1b占病毒基因組的三分之二以上，編碼14個非結構蛋白，包括nsp1a、nsp1b、nsp2-6、nsp7a、nsp7b、nsp8-12是病毒復制所必需的；而orfs?2-7編碼8種結構蛋白，包括糖蛋白(gp2)、包膜蛋白(e)、gp3、gp4、gp5、orf5a、膜蛋白(m)和核衣殼蛋白(n)。prrsv主要包括兩種基因型，基因ⅰ型(歐洲型)和ⅱ型(北美型)，不同基因型之間的全基因組差異高達40％，同一基因型不同毒株間差異高達20％。prrsv易感單核-巨噬細胞，感染后抑制宿主的細胞免疫應答，延遲中和抗體的產生。其高度的遺傳變異和復雜的致病機制使prrsv的防控困難。盡管已經做出了巨大努力來減輕prrsv的影響，但prrsv目前仍未得到充分
2、mrna疫苗因其高效的開發速度和提供抵御病毒攻擊的潛力而受到廣泛關注，與減毒活疫苗和滅活疫苗等傳統疫苗相比，mrna疫苗在安全性、有效性和工業生產方面都有卓越的優勢。盡管抗原由mrna編碼，但疫苗生產中的一致技術簡化了這一過程，確保了及時和可擴展的疫苗開發。目前已有多種傳染性疾病的mrna疫苗取得了較好得研究進展。
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于提供一種高致病性prrsv?mrna疫苗組合物及其應用。
2、為了達到上述目的，本專利技術采用了以下技術手段：
3、本專利技術以高致病性prrsv?jx-a1毒株為模板開發prrsv?mrna疫苗，選擇prrsv?jx-a1毒株的gp3、gp4、gp5、m和n蛋白作為抗原，同時對gp5蛋白的糖基化位點進行了突變，以提高中和性抗體的產生。構建合成了融合蛋白gp345、gp5m、gp5mn和單個結構蛋白gp3、gp4、gp5、m、n的mrna。脂質體包封后獲得mrna-lnps疫苗，以融合蛋白mrna-lnps和相應單個蛋白的mrna-lnps混合免疫小鼠，評價其在小鼠體內的免疫效果。結果表明單個mrna-lnps混合組的體液免疫和細胞免疫水平均高于重組mrna-lnps，其中gp5+m+n，gp3+4+5效果相對最好。
4、因此，在上述研究的基礎上，本專利技術提出了一種高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒mrna疫苗組合物，所述的疫苗組合物選自以下組合中的任一：
5、(1)由prrsv?gp3?mrna、prrsv?gp4?mrna以及prrsv?gp5?mrna組成的mrna疫苗組合物；或
6、(2)由prrsv?gp5?mrna、prrsv膜蛋白mrna以及prrsv核衣殼蛋白mrna組成的mrna疫苗組合物。
7、其中，優選的，所述的prrsv?gp3?mrna、prrsv?gp4?mrna、prrsv?gp5mrna、prrsv膜蛋白mrna以及prrsv核衣殼蛋白mrna是分別由seq?id?no.4-8所示的序列經轉錄后得到n1-甲基假尿嘧啶修飾的mrna。
8、其中，優選的，所述的prrsv?gp5?mrna、prrsv膜蛋白mrna以及prrsv核衣殼蛋白mrna按照等摩爾比混合。
9、其中，優選的，所述的prrsv?gp3?mrna、prrsv?gp4?mrna以及prrsv?gp5?mrna按照等摩爾比混合。
10、進一步的，本專利技術還提出了所述的mrna疫苗組合物在制備預防高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染的mrna疫苗中的應用。
11、再進一步的，本專利技術還提出了一種預防高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染的mrna疫苗，所述的疫苗中含有所述的mrna疫苗組合物。
12、其中，優選的，所述的疫苗中還含有脂質，所述的脂質包括可電離脂質alc-0315，二硬脂酰磷脂酰膽堿(dspc)、膽固醇以及聚脂質dmg-peg2000。
13、其中，優選的，所述的mrna疫苗通過以下方法制備得到：
14、(1)將可電離脂質alc-0315，二硬脂酰磷脂酰膽堿(dspc)、膽固醇、聚脂質dmg-peg2000溶解在乙醇中，得到脂質；
15、(2)將所述prrsv?gp3?mrna、prrsv?gp4?mrna以及prrsv?gp5mrna的混合物或者將prrsv?gp5?mrna、prrsv膜蛋白mrna以及prrsv核衣殼蛋白mrna的混合物溶解于20mm，ph4.5的檸檬酸緩沖液中，得到mrna溶液；
16、(3)將步驟(1)得到的脂質和步驟(2)得到的mrna溶液以脂質與mrna在微流體混合器中制備得到脂質納米顆粒(lnps)；
17、(4)lnps在無rnase的ph?7.4磷酸鹽緩沖液中透析24h，去除乙醇。最后，lnps通過0.22μm的濾器過濾，并存儲在4℃直到使用。
18、其中，優選的，步驟(1)中可電離脂質alc-0315，二硬脂酰磷脂酰膽堿(dspc)、膽固醇、聚脂質dmg-peg2000的摩爾比為46.3：9.4：42.7：1.6，總脂質濃度為19.1mm；步驟(2)中將所述的prrsvgp3?mrna、prrsv?gp4mrna以及prrsv?gp5?mrna按照等摩爾比混合，或者將所述的prrsv?gp5mrna、prrsv膜蛋白mrna以及prrsv核衣殼蛋白mrna按照等摩爾比混合，根據氮磷比為1:6計算出mrna的用量，將mrna溶解于20mm，ph?4.5的檸檬酸緩沖液中。
19、其中，優選的，步驟(3)中將步驟(1)得到的脂質和步驟(2)得到的mrna溶液以體積比為1：3的比例在微流體混合器中制備得到脂質納米顆粒(lnps)
20、相較于現有技術，本專利技術的有益效果是：
21、1、本專利技術基于hp-prrsv?jx-a1株設計了數種prrsv?mrna疫苗，并在小鼠體內進行了詳細的免疫評價，證明了mrna疫苗在預防prrsv感染方面的潛力；
22、2、本專利技術構建制備了prrsv融合蛋白和單本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine?reproductive?and?respiratorysyndrome?virus，PRRSV)mRNA疫苗組合物，其特征在于，所述的疫苗組合物選自以下組合中的任一：
2.如權利要求1所述的mRNA疫苗組合物，其特征在于，所述的PRRSV?GP3mRNA、PRRSVGP4?mRNA、PRRSV?GP5?mRNA、PRRSV膜蛋白mRNA以及PRRSV核衣殼蛋白mRNA是分別由SEQ?IDNO.4-8所示的序列經轉錄后得到N1-甲基假尿嘧啶修飾的mRNA。
3.如權利要求1或2所述的mRNA疫苗組合物，其特征在于，所述的PRRSV?GP5?mRNA、PRRSV膜蛋白mRNA以及PRRSV核衣殼蛋白mRNA按照等摩爾比混合。
4.如權利要求1或2所述的mRNA疫苗組合物，其特征在于，所述的PRRSV?GP3?mRNA、PRRSV?GP4?mRNA以及PRRSV?GP5?mRNA按照等摩爾比混合。
5.權利要求1-4任一項所述的mRNA疫苗組合物在制備預防高致病性豬繁殖與呼吸綜合征
6.一種預防高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染的mRNA疫苗，其特征在于，所述的疫苗中含有權利要求1-4任一項所述的mRNA疫苗組合物。
7.如權利要求6所述的mRNA疫苗，其特征在于，所述的疫苗中還含有脂質，所述的脂質包括可電離脂質ALC-0315，二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)、膽固醇以及聚脂質DMG-PEG2000。
8.如權利要求7所述的mRNA疫苗，其特征在于，所述的mRNA疫苗通過以下方法制備得到：
9.如權利要求8所述的mRNA疫苗，其特征在于，步驟(1)中可電離脂質ALC-0315，二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)、膽固醇、聚脂質DMG-PEG2000的摩爾比為46.3：9.4：42.7：1.6，總脂質濃度為19.1mM；步驟(2)中將所述的PRRSV?GP3?mRNA、PRRSV?GP4?mRNA以及PRRSV?GP5?mRNA按照等摩爾比混合，或者將所述的PRRSV?GP5?mRNA、PRRSV膜蛋白mRNA以及PRRSV核衣殼蛋白mRNA按照等摩爾比混合，根據氮磷比為1:6計算出mRNA的用量，將mRNA溶解于20mM，pH4.5的檸檬酸緩沖液中。
10.如權利要求9所述的mRNA疫苗，其特征在于，步驟(3)中將步驟(1)得到的脂質和步驟(2)得到的mRNA溶液以體積比為1：3的比例在微流體混合器中制備得到脂質納米顆粒(LNPs)。
...【技術特征摘要】
1.一種高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine?reproductive?and?respiratorysyndrome?virus，prrsv)mrna疫苗組合物，其特征在于，所述的疫苗組合物選自以下組合中的任一：
2.如權利要求1所述的mrna疫苗組合物，其特征在于，所述的prrsv?gp3mrna、prrsvgp4?mrna、prrsv?gp5?mrna、prrsv膜蛋白mrna以及prrsv核衣殼蛋白mrna是分別由seq?idno.4-8所示的序列經轉錄后得到n1-甲基假尿嘧啶修飾的mrna。
3.如權利要求1或2所述的mrna疫苗組合物，其特征在于，所述的prrsv?gp5?mrna、prrsv膜蛋白mrna以及prrsv核衣殼蛋白mrna按照等摩爾比混合。
4.如權利要求1或2所述的mrna疫苗組合物，其特征在于，所述的prrsv?gp3?mrna、prrsv?gp4?mrna以及prrsv?gp5?mrna按照等摩爾比混合。
5.權利要求1-4任一項所述的mrna疫苗組合物在制備預防高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染的mrna疫苗中的應用。
6.一種預防高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染的mrna疫苗，其特征在于，所述的疫苗中含有...
【專利技術屬性】
技術研發人員：郭慧琛，柳海云，孫世琪，麻玉清，滕志東，江麗馨，喬璐，張韻，
申請(專利權)人：中國農業科學院蘭州獸醫研究所中國動物衛生與流行病學中心蘭州分中心，
類型：發明
國別省市：
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