【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物醫學領域，涉及一種構建轉線粒體人臍靜脈內皮細胞模型的方法，是將供體細胞的線粒體與經羅丹明6g處理而線粒體dna缺失的人臍靜脈內皮細胞融合制備轉線粒體人臍靜脈內皮細胞模型的方法。
技術介紹
1、線粒體基因突變導致的線粒體功能異常可引發多種疾病，累及多個組織和器官。部分線粒體dna突變可引發全身癥狀，如線粒體腦肌病伴乳酸血癥和卒中樣發作綜合征(melas)，肌陣攣癲癇合并破碎紅纖維綜合征(merrf)，kearns-sayre綜合征等。而另一些線粒體基因突變只在特定的組織發病，如leber’s遺傳性視神經病，糖尿病和心肌肥大等。對于具有組織特異性的線粒體dna致病突變，明確其對發病組織或細胞的影響，才能深入揭示疾病發生的機理。血管內皮損傷在母系遺傳性高血壓、母系遺傳性糖尿病、母系遺傳性冠心病等多種線粒體dna突變相關疾病的病理機制中起著重要作用。因此明確線粒體基因突變及其所造成的線粒體功能障礙對血管內皮細胞功能的影響，對于揭示突變在血管內皮損傷相關母系遺傳性疾病病理過程中的作用具有重要意義。但基于倫理和可操作性，從臨床直接取得血管內皮組織用于實驗研究并不可行，而構建特定線粒體dna突變的動物模型目前還存在技術瓶頸，所以使用體外來源的人血管內皮細胞構建線粒體基因突變模型成為最佳選擇。在進行血管內皮細胞相關研究時，通常選用的細胞模型為人臍靜脈內皮細胞。本專利技術通過使用含有羅丹明6g的抑制培養基培養人臍靜脈內皮細胞，抑制其線粒體dna復制。然后將線粒體dna缺失的人臍靜脈內皮細胞與攜帶致病突變或正常對照的供體線粒體(永
技術實現思路
1、本專利技術的目的是提供一種構建轉線粒體人臍靜脈內皮細胞模型的方法，該方法同時適用于攜帶致病線粒體dna突變和不攜帶致病突變正常對照的轉線粒體人臍靜脈內皮細胞的構建。
2、本專利技術通過以下步驟實現轉線粒體人臍靜脈內皮細胞模型的構建：
3、1.制備線粒體dna缺失的人臍靜脈內皮細胞
4、(1)配制含有羅丹明6g的抑制培養基和細胞懸浮液，配方如下：
5、抑制培養基：每ml培養基含有重組人r3胰島素樣生長因子-1?15ng，成纖維細胞生長因子-2?10ng，表皮生長因子5ng，氫化可的松琥珀酸單酯1μg，肝素90μg，維生素c?50μg，丙酮酸鈉100μg，尿嘧啶核苷50ug，羅丹明6g?3μg和5％體積百分比的胎牛血清，余量為dmem/f12培養基，所述dmem/f12培養基為dmem高糖培養基和f12培養基按照體積比1:1混合而成；
6、細胞懸浮液：每ml細胞懸浮液含有重組人r3胰島素樣生長因子-1?15ng，成纖維細胞生長因子-2?10ng，表皮生長因子5ng，氫化可的松琥珀酸單酯1μg，肝素90μg，維生素c?50μg和5％體積百分比的胎牛血清，余量為dmem/f12培養基，所述dmem/f12培養基為dmem高糖培養基和f12培養基按照體積比1:1混合而成。
7、(2)在37℃，5％?co2，飽和濕度的恒溫培養箱中，使用抑制培養基培養人臍靜脈內皮細胞7天，每天更換抑制培養基，抑制其線粒體dna復制。
8、(3)胰酶消化線粒體dna缺失的人臍靜脈內皮細胞，pbs清洗，1000轉/分鐘離心3分鐘，去除上清液，按照1×106細胞/ml的濃度使用細胞懸浮液重懸細胞，取2ml細胞加入離心管并放入37℃，5％?co2，飽和濕度的恒溫培養箱中備用。
9、2.去除永生化淋巴細胞的細胞核獲得供體線粒體
10、(1)配制淋巴細胞培養基，離心液和胞質液
11、淋巴細胞培養基：每ml培養基含有丙酮酸鈉100μg，尿嘧啶核苷50ug，10％體積百分比的胎牛血清，余量為rpmi?1640培養基；
12、離心液：每ml離心液含有12.5％質量百分比的ficoll和細胞松弛素b?20μg，余量為dmem/f12培養基；
13、胞質液：每ml胞質液含有5％體積百分比的胎牛血清和尿嘧啶核苷50ug，余量為dmem/f12(不含ca2+)培養基。
14、(2)制備ficoll密度梯度
15、a.配制50％(w/w)ficoll母液：將ficoll溶解在等重量的超純水中，滅菌并緩慢放氣20分鐘，在4℃下攪拌過夜以溶解；
16、b.按照下表1準備去細胞核梯度母液：
17、表1
18、
19、
20、c.按照下表2體積依次沿管壁向滅菌的硝酸纖維素離心管(適配beckman超速離心機l-80的sw41轉子)中緩慢加入各個梯度，在25％，17％，16％，15％和12.5％梯度之間可觀察到明顯的分界。梯度在使用前準備，可在37℃，5％?co2，飽和濕度的恒溫培養箱中存放<12小時；
21、表2
22、 ficoll溶液濃度(％) 25 17 16 15 12.5 體積(ml) 2 2 0.5 0.5 2
23、(3)使用淋巴細胞培養基培養線粒體供體永生化淋巴細胞至對數生長期，收集細胞(1.5×107)并以5ml預熱至37℃的離心液反復吹打將其充分懸浮。
24、(4)取4ml離心液重懸的細胞加入步驟c所述ficoll梯度，并使之形成上層。
25、(5)將離心管放入離心適配管中，并用離心液配平。
26、(6)將離心適配管放入sw41轉子，轉子放入beckman?l-80超速離心機，設定溫度37℃，真空，25000轉/分鐘，離心1小時。
27、(7)離心后可見細胞質層位于15％和12.5％的ficoll交界處，細胞核位于25％和17％的ficoll交界處，使用2ml注射器針頭水平插入細胞質層下方，抽取白色的細胞質。
28、(8)使用dmem/f12(不含ca2+)將抽取的細胞質稀釋10倍，離心以去除殘留的ficoll和細胞松弛素b。
29、(9)使用2ml本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種構建轉線粒體人臍靜脈內皮細胞模型的方法，其特征在于，通過以下步驟實現：
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)制備線粒體DNA缺失的人臍靜脈內皮細胞通過以下步驟實現：
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的抑制培養基為：每ml培養基含有重組人R3胰島素樣生長因子-1?15ng，成纖維細胞生長因子-2?10ng，表皮生長因子5ng，氫化可的松琥珀酸單酯1μg，肝素90μg，維生素C?50μg，丙酮酸鈉100μg，尿嘧啶核苷50ug，羅丹明6G?3μg和5％體積百分比的胎牛血清，余量為DMEM/F12培養基，所述DMEM/F12培養基為DMEM高糖培養基和F12培養基按照體積比1:1混合而成。
4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的細胞懸浮液為：每ml細胞懸浮液含有重組人R3胰島素樣生長因子-1?15ng，成纖維細胞生長因子-2?10ng，表皮生長因子5ng，氫化可的松琥珀酸單酯1μg，肝素90μg，維生素C?50μg和5％體積百分比的胎牛血清，余量為DMEM/F12培養基，所述DMEM/F12培養基為
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)去除永生化淋巴細胞的細胞核獲得供體線粒體通過以下步驟實現：
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述的淋巴細胞培養基為：每ml培養基含有丙酮酸鈉100μg，尿嘧啶核苷50ug，10％體積百分比的胎牛血清，余量為RPMI?1640培養基。
7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述的離心液為：每ml離心液含有12.5％質量百分比的Ficoll和細胞松弛素B?20μg，余量為DMEM/F12培養基。
8.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述的胞質液為：每ml胞質液含有5％體積百分比的胎牛血清和尿嘧啶核苷50ug，余量為不含Ca2+的DMEM/F12培養基。
9.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)硝酸纖維素離心管Ficoll梯度通過以下步驟實現：
10.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)融合線粒體DNA缺失的人臍靜脈內皮細胞和永生化淋巴細胞來源的供體線粒體通過以下步驟實現：
11.根據權利要求10所述的方法，其特征在于，所述的緩和培養基為：每ml培養基含有重組人R3胰島素樣生長因子-1?15ng，成纖維細胞生長因子-2?10ng，表皮生長因子5ng，氫化可的松琥珀酸單酯1μg，肝素90μg，維生素C?50μg，丙酮酸鈉100μg，尿嘧啶核苷50ug和5％體積百分比的胎牛血清，余量為DMEM/F12培養基，所述DMEM/F12培養基為DMEM高糖培養基和F12培養基按照體積比1:1混合而成。
12.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)轉線粒體人臍靜脈內皮細胞的篩選培養及鑒定通過以下步驟實現：
13.根據權利要求12所述的方法，其特征在于，所述的緩和培養基為：每ml培養基含有重組人R3胰島素樣生長因子-1?15ng，成纖維細胞生長因子-2?10ng，表皮生長因子5ng，氫化可的松琥珀酸單酯1μg，肝素90μg，維生素C?50μg和5％體積百分比的胎牛血清，余量為DMEM/F12培養基，所述DMEM/F12培養基為DMEM高糖培養基和F12培養基按照體積比1:1混合而成。
...【技術特征摘要】
1.一種構建轉線粒體人臍靜脈內皮細胞模型的方法，其特征在于，通過以下步驟實現：
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)制備線粒體dna缺失的人臍靜脈內皮細胞通過以下步驟實現：
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的抑制培養基為：每ml培養基含有重組人r3胰島素樣生長因子-1?15ng，成纖維細胞生長因子-2?10ng，表皮生長因子5ng，氫化可的松琥珀酸單酯1μg，肝素90μg，維生素c?50μg，丙酮酸鈉100μg，尿嘧啶核苷50ug，羅丹明6g?3μg和5％體積百分比的胎牛血清，余量為dmem/f12培養基，所述dmem/f12培養基為dmem高糖培養基和f12培養基按照體積比1:1混合而成。
4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的細胞懸浮液為：每ml細胞懸浮液含有重組人r3胰島素樣生長因子-1?15ng，成纖維細胞生長因子-2?10ng，表皮生長因子5ng，氫化可的松琥珀酸單酯1μg，肝素90μg，維生素c?50μg和5％體積百分比的胎牛血清，余量為dmem/f12培養基，所述dmem/f12培養基為dmem高糖培養基和f12培養基按照體積比1:1混合而成。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)去除永生化淋巴細胞的細胞核獲得供體線粒體通過以下步驟實現：
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述的淋巴細胞培養基為：每ml培養基含有丙酮酸鈉100μg，尿嘧啶核苷50ug，10％體積百分比的胎牛血清，余量為rpmi?1640培養基。
7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述的離心液為：每ml離心液含有12.5％質量百分比的f...
【專利技術屬性】
技術研發人員：管敏鑫，賈子冬，冀延春，孟飛龍，賀云帆，陳暉，
申請(專利權)人：浙江大學，
類型：發明
國別省市：
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