【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于基因編輯，具體涉及基于crispr-cas9系統(tǒng)的噬菌體基因組編輯載體及其編輯方法和應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、金黃色葡萄球菌是一種常見的革蘭陽性菌，其廣泛存在于自然界中。作為一種重要的臨床致病菌和食源性病原菌，金黃色葡萄球菌可以引起人類和動(dòng)物嚴(yán)重感染，包括皮膚和軟組織感染、肺炎、敗血癥和關(guān)節(jié)炎等癥狀。目前，臨床上主要通過抗生素來治療由金黃色葡萄球菌引發(fā)的感染，部分國家和地區(qū)也開始嘗試使用噬菌體療法。然而，目前從自然界分離獲得的野生型噬菌體在臨床治療中仍存在一些局限性，并且由于噬菌體大多數(shù)開放閱讀框的功能未知，導(dǎo)致其功能基因組學(xué)研究滯后。因此，亟需開發(fā)建立一種針對(duì)金黃色葡萄球菌噬菌體的基因編輯方法。
2、目前，噬菌體基因組編輯的方法主要包括隨機(jī)誘變、經(jīng)典同源重組系統(tǒng)、電轉(zhuǎn)化dna的噬菌體重組策略等。然而，這些傳統(tǒng)方法不僅耗時(shí)耗力，且編輯效率較低，極大地限制了對(duì)噬菌體基因組結(jié)構(gòu)和功能的深入研究。近年來，隨著多種類型crispr-cas系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)，其已被改造為高效的基因編輯工具，并被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物、植物、細(xì)菌等多種生物中，但在噬菌體基因組編輯中的應(yīng)用仍處于探索階段。
3、crispr-cas系統(tǒng)是細(xì)菌和古細(xì)菌用于保護(hù)自身免受外源噬菌體或質(zhì)粒入侵的適應(yīng)性免疫防御系統(tǒng)。根據(jù)cas蛋白的種類，crispr-cas系統(tǒng)可以分為2大類，7種類型，54種亞型。其中，ii型crispr-cas系統(tǒng)的效應(yīng)蛋白是cas9，因其結(jié)構(gòu)較為簡單，已被廣泛應(yīng)用于基因編輯領(lǐng)域。目前，廣泛使用的cas9蛋白是來源于嗜熱鏈球菌中的s
4、迄今為止，crispr-cas系統(tǒng)已被大量運(yùn)用實(shí)現(xiàn)了其他細(xì)菌噬菌體基因組編輯，如沙門菌、銅綠假單胞菌。但是，對(duì)于金黃色葡萄球菌噬菌體基因組還沒有廣泛適用的編輯方法報(bào)道。同時(shí)，有研究報(bào)道，在基因組較大的噬菌體中實(shí)現(xiàn)噬菌體基因組的編輯效果往往不穩(wěn)定，因此，通過對(duì)crispr-cas9系統(tǒng)的改造，使其能夠廣泛應(yīng)用于金黃色葡萄球菌噬菌體基因組的編輯，將為后續(xù)基因生物學(xué)功能研究、工程噬菌體的改造提供新的策略。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、專利技術(shù)目的：本專利技術(shù)所要解決的技術(shù)問題是提供了基于crispr-cas9系統(tǒng)的噬菌體基因組編輯載體。
2、本專利技術(shù)還要解決的技術(shù)問題是提供了一種ptarget質(zhì)粒。
3、本專利技術(shù)還要解決的技術(shù)問題是提供了一種crispr-cas雙質(zhì)粒系統(tǒng)。
4、本專利技術(shù)還要解決的技術(shù)問題是提供了一種噬菌體基因組編輯載體的工程菌。
5、本專利技術(shù)還要解決的技術(shù)問題是提供了一種所述噬菌體基因組編輯載體的構(gòu)建方法。
6、本專利技術(shù)最后要解決的技術(shù)問題是提供了基于crispr-cas9系統(tǒng)的噬菌體基因組編輯方法。
7、技術(shù)方案：為了解決上述技術(shù)問題，本專利技術(shù)第一方面提供了基于crispr-cas9系統(tǒng)的噬菌體基因組編輯載體，所述噬菌體基因組編輯載體包括抗性篩選標(biāo)記、啟動(dòng)子prpsl、cas9核酸酶基因、內(nèi)源u6啟動(dòng)子、sgrna序列、內(nèi)源u6終止子以及復(fù)制子，所述cas9核酸酶基因選自表皮葡萄球菌(s.epidermidis)的secas9核酸酶基因。
8、其中，所述噬菌體基因組編輯載體的序列如seq?id?no.1所示。
9、本專利技術(shù)第二方面還提供了一種ptarget質(zhì)粒，所述ptarget質(zhì)粒是將目的基因的spacer片段與所述的噬菌體基因組編輯載體連接得到，所述目的基因的spacer片段為通過pam位點(diǎn)要求設(shè)計(jì)并擴(kuò)增得到。
10、本專利技術(shù)第三方面還提供了一種crispr-cas雙質(zhì)粒系統(tǒng)，所述crispr-cas雙質(zhì)粒系統(tǒng)包括所述的ptarget質(zhì)粒，還包括pedit質(zhì)粒，所述pedit質(zhì)粒是將噬菌體基因組中目的基因的上游同源臂片段和下游同源臂片段導(dǎo)入質(zhì)粒中得到，所述目的基因的上游同源臂片段和下游同源臂片段分別通過設(shè)計(jì)引物并通過pcr擴(kuò)增得到。
11、本專利技術(shù)第四方面還提供了一種工程菌，所述工程菌含有所述的基于crispr-cas9系統(tǒng)的噬菌體基因組編輯載體、所述的ptarget質(zhì)?；蛩龅腸rispr-cas雙質(zhì)粒系統(tǒng)。
12、本專利技術(shù)第五方面還提供了所述的基因編輯載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟：
13、1)將啟動(dòng)子prpsl、secas9、內(nèi)源u6啟動(dòng)子以及sgrna基因序列連接起來，導(dǎo)入puc57質(zhì)粒中得到secas9-puc57質(zhì)粒，以secas9-puc57質(zhì)粒為模板，通過pcr擴(kuò)增得到secas9編輯系統(tǒng)元件的基因片段；
14、2)將secas9編輯系統(tǒng)元件的基因片段連接至線性載體上，即可得到基于crispr-cas9系統(tǒng)的噬菌體基因組編輯載體。
15、作為優(yōu)選，所述線性載體包括但不僅限于prab11雙酶切后的線性載體，所述內(nèi)切酶包括但不僅限于bamh?i和kpn?i。
16、本專利技術(shù)第六方面還提供了所述的ptarget質(zhì)粒的構(gòu)建方法，包括以下步驟：
17、1)構(gòu)建所述的基于crispr-cas9系統(tǒng)的噬菌體基因組編輯載體；
18、2)根據(jù)secas9核酸酶的pam位點(diǎn)要求，確定目的基因上的編輯位點(diǎn)，設(shè)計(jì)出靶向序列，并構(gòu)建至步驟1)得到的crispr-cas9系統(tǒng)的噬菌體基因組編輯質(zhì)粒上，獲得ptarget質(zhì)粒。
19、本專利技術(shù)第七方面還提供了基于crispr-cas9系統(tǒng)的噬菌體基因組編輯方法，包括以下步驟：
20、1)構(gòu)建所述的基于crispr-cas9系統(tǒng)的噬菌體基因組編輯載體；
21、2)根據(jù)secas9核酸酶的pam位點(diǎn)要求，確定目的基因上的編輯位點(diǎn)，設(shè)計(jì)出靶向序列，并構(gòu)建至步驟1)得到的crispr-cas9系統(tǒng)的噬菌體基因組編輯質(zhì)粒上，獲得ptarget質(zhì)粒，隨后將其電轉(zhuǎn)入金黃色葡萄球菌感受態(tài)細(xì)胞中，獲得靶向菌株；
22、3)將編輯位點(diǎn)的上、下游各200bp?dna序列構(gòu)建至載體上，獲得pedit質(zhì)粒，隨后將其電轉(zhuǎn)入金黃色葡萄球菌感受態(tài)細(xì)胞中，獲得編輯菌株；
23、4)利用噬菌體感染步驟3)得到的編輯菌株，促使噬菌體發(fā)生同源重組，隨后收獲噬菌體，進(jìn)一步將所述噬菌體再次感染步驟2)的靶向菌株，通過反向篩選獲得噬菌體突變株，實(shí)現(xiàn)對(duì)噬菌體基因組的基因片段缺失、插入或定點(diǎn)突變編輯。
24、其中，步驟2)中pam位點(diǎn)選擇要求為5’-nngrrt-3’，所述目的基因包括gp036基因或gp170基因。
25、其中，步驟本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.基于CRISPR-Cas9系統(tǒng)的噬菌體基因組編輯載體，其特征在于，所述噬菌體基因組編輯載體包括抗性篩選標(biāo)記、啟動(dòng)子PrpsL、Cas9核酸酶基因、內(nèi)源U6啟動(dòng)子、sgRNA序列、內(nèi)源U6終止子以及復(fù)制子，所述Cas9核酸酶基因選自表皮葡萄球菌（S.?epidermidis）的SeCas9核酸酶基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于CRISPR-Cas9系統(tǒng)的噬菌體基因組編輯載體，其特征在于，所述噬菌體基因組編輯載體的序列如SEQ?ID?No.1所示。
3.一種pTarget質(zhì)粒，其特征在于，所述pTarget質(zhì)粒是將目的基因的spacer片段與權(quán)利要求1或2所述的噬菌體基因組編輯載體連接得到，所述目的基因的spacer片段為通過PAM位點(diǎn)要求設(shè)計(jì)并擴(kuò)增得到。
4.一種CRISPR-Cas雙質(zhì)粒系統(tǒng)，其特征在于，所述CRISPR-Cas雙質(zhì)粒系統(tǒng)包括權(quán)利要求4所述的pTarget質(zhì)粒，還包括pEdit質(zhì)粒，所述pEdit質(zhì)粒是將噬菌體基因組中目的基因的上游同源臂片段和下游同源臂片段導(dǎo)入質(zhì)粒中得到，所述目的基因的上游同源臂片段和下游同源臂片段分別
5.一種工程菌，其特征在于，所述工程菌含有權(quán)利要求1或2所述的基于CRISPR-Cas9系統(tǒng)的噬菌體基因組編輯載體、權(quán)利要求3所述的pTarget質(zhì)?；驒?quán)利要求4所述的CRISPR-Cas雙質(zhì)粒系統(tǒng)。
6.權(quán)利要求1或2所述的基因編輯載體的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：
7.權(quán)利要求3所述的pTarget質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：
8.基于CRISPR-Cas9系統(tǒng)的噬菌體基因組編輯方法，其特征在于，包括以下步驟：
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的基于CRISPR-Cas9系統(tǒng)的噬菌體基因組編輯方法，其特征在于，步驟2）中PAM位點(diǎn)選擇要求為5’-NNGRRT-3’，所述目的基因包括gp036基因或gp170基因。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的基于CRISPR-Cas9系統(tǒng)的噬菌體基因組編輯方法，其特征在于，步驟4）中所述噬菌體包括金黃色葡萄球菌philPLA-RODI噬菌體。
...【技術(shù)特征摘要】
1.基于crispr-cas9系統(tǒng)的噬菌體基因組編輯載體，其特征在于，所述噬菌體基因組編輯載體包括抗性篩選標(biāo)記、啟動(dòng)子prpsl、cas9核酸酶基因、內(nèi)源u6啟動(dòng)子、sgrna序列、內(nèi)源u6終止子以及復(fù)制子，所述cas9核酸酶基因選自表皮葡萄球菌（s.?epidermidis）的secas9核酸酶基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于crispr-cas9系統(tǒng)的噬菌體基因組編輯載體，其特征在于，所述噬菌體基因組編輯載體的序列如seq?id?no.1所示。
3.一種ptarget質(zhì)粒，其特征在于，所述ptarget質(zhì)粒是將目的基因的spacer片段與權(quán)利要求1或2所述的噬菌體基因組編輯載體連接得到，所述目的基因的spacer片段為通過pam位點(diǎn)要求設(shè)計(jì)并擴(kuò)增得到。
4.一種crispr-cas雙質(zhì)粒系統(tǒng)，其特征在于，所述crispr-cas雙質(zhì)粒系統(tǒng)包括權(quán)利要求4所述的ptarget質(zhì)粒，還包括pedit質(zhì)粒，所述pedit質(zhì)粒是將噬菌體基因組中目的基因的上游同源臂片段和下游同源臂片段導(dǎo)入質(zhì)粒中得到，所述目...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李求春，曹穎倩，李揚(yáng)，焦新安，趙昌彬，陳昕海，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：揚(yáng)州大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：
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