【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及醫藥衛生的，更具體地說，它涉及一種提高t細胞對腫瘤微環境適應性的方法。
技術介紹
1、腫瘤新抗原（neoantigen)是由腫瘤細胞突變基因編碼的新生抗原，主要由基因點突變、刪除突變、基因融合等產生的與正常細胞表達的蛋白不一樣的新的異常蛋白。這些蛋白經過酶解之后形成的多肽片段，作為抗原經過dc細胞遞呈給t細胞，可促使t細胞變為特異性地識別腫瘤新抗原的成熟活化t細胞，并使這些活化的t細胞數量增殖。利用腫瘤新抗原的免疫活性，根據腫瘤細胞突變的情況設計合成新抗原，對t細胞，nk細胞和巨噬細胞等免疫細胞進行體外進行基因改造，以產生腫瘤新抗原免疫細胞，對患者進行免疫注射，達到治療的效果。
2、pd-l1稱程序性死亡配體1，為程序性死亡受體1（pd-1）的配體。正常情況下，t細胞具有殺滅癌細胞的功能。然而，癌細胞的表面表達pd-l1，與t細胞表面的pd-1結合，使t細胞的活性降低，誘導t細胞凋亡瓦解、抑制t細胞的增殖。癌細胞獲得自救，從而實現免疫逃逸。
3、基于這一原理，目前已有上市的針對pd-1免疫檢查點的抑制劑，這種藥物通過阻斷腫瘤所造成的免疫逃逸機制，從而激活身體自身的免疫細胞，殺死腫瘤細胞，達到治療腫瘤的目的。pd-1抑制劑雖然是一種有效的免疫治療藥物，但在使用過程中可能會引發多種副作用，這些副作用的范圍從輕微的皮膚反應到嚴重的免疫相關炎癥反應不等?。同時，傳統新抗原免疫療法受hla(人類白細胞抗原)和抗原表達的雙重限制，使適用新抗原免疫療法的患者受限。
技術實現思路
1、針對現有技術存在的不足，本專利技術的目的在于提供一種提高t細胞對腫瘤微環境適應性的方法，具有提高安全性和腫瘤微環境適應性的優點。
2、本專利技術的上述技術目的是通過以下技術方案得以實現的，一種提高t細胞對腫瘤微環境適應性的方法，包括以下步驟：
3、s1、制備腫瘤新抗原mrna；
4、s2、采集分離pbmc，獲得初始t細胞；
5、s3、使用所述初始t細胞誘導獲得dc細胞；
6、s4、使用所述腫瘤新抗原mrna修飾所述dc細胞；
7、s5、通過crispr-cas9電轉敲除所述初始t細胞的pd-1；
8、s6、將經修飾的dc細胞加入至已敲除pd-1的t細胞中，共同孵育擴增，獲得經處理的t細胞。
9、在其中一個實施例中，所述s1包括以下步驟：
10、s11、根據腫瘤新抗原基因序列，設計構建表達載體，質粒經密碼子優化，獲得重組質粒；
11、s12、利用內切酶對所述重組質粒進行質粒線性化，再純化回收，獲得線性化質粒；
12、s13、利用體外轉錄試劑對所述線性化質粒進行體外轉錄，再純化回收，獲得所述腫瘤新抗原mrna。
13、在其中一個實施例中，s2包括以下步驟：
14、s21、采集外周血，并加入淋巴分離液，離心分離，吸取白膜層細胞，加入生理鹽水重懸，離心棄上清，后加入培養基重懸，細胞計數；
15、s22、再加入培養基孵育，收集上層懸浮細胞，離心棄上清，后加入培養基重懸，細胞計數，獲得所述初始t細胞。
16、在其中一個實施例中，所述s3中的初始t細胞與所述s5中的初始t細胞的細胞比例為1:（3-4.5）。
17、在其中一個實施例中，所述s3包括以下步驟：
18、s31、將培養基加入至所述初始t細胞中，并加入il-4、gm-csf進行培養；
19、s32、更換培養基，再加入il-4、gm-csf繼續培養；
20、s33、后加入tmf-α繼續培養，獲得所述dc細胞。
21、在其中一個實施例中，所述s3中細胞因子的終濃度分別為：il-4為40-60ng/ml，gm-csf為50-150ng/ml，tmf-α為200-300ng/ml。
22、在其中一個實施例中，所述s4包括以下步驟：對所述dc細胞進行計數，每1×107cells加入所述腫瘤特異性抗原mrna?25-30ug，電擊轉導，再轉移至含重組人il-2蛋白的培養基中培養，獲得所述經修飾的dc細胞；
23、其中，所述dc細胞的電擊轉導修飾操作發生于其培養的第7-8天。
24、在其中一個實施例中，所述s5包括以下步驟：
25、s51、混合cas9蛋白與sgrna，獲得cas9蛋白混合液；
26、s52、取用所述初始t細胞，每1×107cells加入所述cas9蛋白混合液18-25ug，電擊轉導，再接種至培養瓶中，并加入抗人cd3單克隆抗體培養，獲得所述已敲除pd-1的t細胞。
27、在其中一個實施例中，所述s4和所述s5中的電擊轉導的電壓為360v，瞬轉時間為1ms。
28、在其中一個實施例中，所述s6包括以下步驟：將所述經修飾的dc細胞加入至所述已敲除pd-1的t細胞中，混合培養8-10天，取樣檢測、補液培養，獲得所述經處理的t細胞。
29、上述一種提高t細胞對腫瘤微環境適應性的方法，具有以下有益效果：
30、其一，使用腫瘤新抗原mrna修飾dc細胞，并通過crispr-cas9修飾t細胞，在提高dc細胞轉染效率及pd-1的敲除效率的同時，將經修飾的dc細胞及t細胞共同孵育擴增，可增強工藝通用性，降低生產成本及提高安全性；
31、其二，培養獲得的細胞對腫瘤微環境適應性強；
32、其三，通過本專利技術處理的t細胞對每位患者有其特定免疫原性，最大限度納入腫瘤患者，能夠激發自體免疫系統對腫瘤細胞進行攻擊，讓更多的患者通過個體化的治療長期獲益。
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1.一種提高T細胞對腫瘤微環境適應性的方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的一種提高T細胞對腫瘤微環境適應性的方法，其特征在于，所述S1包括以下步驟：
3.根據權利要求1所述的一種提高T細胞對腫瘤微環境適應性的方法，其特征在于，S2包括以下步驟：
4.根據權利要求1所述的一種提高T細胞對腫瘤微環境適應性的方法，其特征在于：所述S3中的初始T細胞與所述S5中的初始T細胞的細胞比例1:（3-4.5）。
5.根據權利要求1所述的一種提高T細胞對腫瘤微環境適應性的方法，其特征在于，所述S3包括以下步驟：
6.根據權利要求5所述的一種提高T細胞對腫瘤微環境適應性的方法，其特征在于，所述S3中細胞因子的終濃度分別為：IL-4為40-60ng/ml，GM-CSF為50-150ng/ml，TMF-α為200-300ng/ml。
7.根據權利要求1所述的一種提高T細胞對腫瘤微環境適應性的方法，其特征在于，所述S4包括以下步驟：對所述DC細胞進行計數，每1×107cells加入所述腫瘤特異性抗原mRNA25-
8.根據權利要求7所述的一種提高T細胞對腫瘤微環境適應性的方法，其特征在于，所述S5包括以下步驟：
9.根據權利要求8所述的一種提高T細胞對腫瘤微環境適應性的方法，其特征在于，所述S4和所述S5中的電擊轉導的電壓為360V，瞬轉時間為1ms。
10.根據權利要求1所述的一種提高T細胞對腫瘤微環境適應性的方法，其特征在于，所述S6包括以下步驟：將所述經修飾的DC細胞加入至所述已敲除PD-1的T細胞中，混合培養8-10天，取樣檢測、補液培養，獲得所述經處理的T細胞。
...【技術特征摘要】
1.一種提高t細胞對腫瘤微環境適應性的方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的一種提高t細胞對腫瘤微環境適應性的方法，其特征在于，所述s1包括以下步驟：
3.根據權利要求1所述的一種提高t細胞對腫瘤微環境適應性的方法，其特征在于，s2包括以下步驟：
4.根據權利要求1所述的一種提高t細胞對腫瘤微環境適應性的方法，其特征在于：所述s3中的初始t細胞與所述s5中的初始t細胞的細胞比例1:（3-4.5）。
5.根據權利要求1所述的一種提高t細胞對腫瘤微環境適應性的方法，其特征在于，所述s3包括以下步驟：
6.根據權利要求5所述的一種提高t細胞對腫瘤微環境適應性的方法，其特征在于，所述s3中細胞因子的終濃度分別為：il-4為40-60ng/ml，gm-csf為50-150ng/ml，tmf-α為200-300ng/...
【專利技術屬性】
技術研發人員：杜永彪，安鴻，鐘浩，李增寶，
申請(專利權)人：康儲科技廣東有限公司，
類型：發明
國別省市：
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