【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物醫藥，具體涉及一種臍帶間充質干細胞的培養基及臍帶間充質干細胞的分離培養方法。
技術介紹
1、臍帶間充質干細胞(umbilical?cord?mesenchymal?stem?cells，uc-mscs)是一種來源于新生兒臍帶間充質組織的干細胞，具有多向分化、自我更新和免疫調節等功能。同時無致瘤性，安全性高，且來源豐富、取材方便，取材過程避免了對人體的二次創傷和倫理法律問題，還具有低免疫原性，異體使用不產生排斥反應，是臨床研究與應用的合適材料來源，被廣泛應用于以組織修復和再生為目標的干細胞治療中，具有廣闊的臨床應用前景。
2、干細胞移植治療，是把健康的干細胞移植到患者體內，以達到修復或替換受損細胞或組織，從而達到治愈的目的。干細胞具有自我更新、多向分化潛能，能治療神經系統疾病、免疫系統疾病、代謝疾病和一些衰老損傷類疾病。
3、目前，全球已有21款干細胞治療產品獲批上市，其中10種為間充質干細胞制品。截止2023年底，中國有129個干細胞臨床研究通過備案，其中74個為間充質干細胞制品；現有68個干細胞制劑獲得ind默示許可，其中43個為間充質干細胞制品。
4、干細胞被認為是替代治療的理想細胞來源。然而，最早開發的胚胎干細胞受到倫理學和法律的限制，而且存在致瘤性和非預期分化等風險，難以開發成細胞制劑。誘導多能干細胞可以模擬胚胎干細胞的多能性，沒有倫理爭議，但仍然存在致瘤性和非預期分化等風險。成體間充質干細胞無倫理爭議，而且可實現自體移植，因此成為很有吸引力和開發前景的選擇。最早使用
5、人的臍帶在胚胎期的第十五周形成，到正常分娩階段，足月嬰兒臍帶平均長度在50cm～60cm，重量30g～60g不等，直徑0.6cm～2cm不等。臍帶間充質干細胞可以從臍帶的不同部位分離獲得，包括臍帶血液、臍靜脈內皮下層、臍帶上皮層以及華通氏膠層等。其中，華通氏膠是指包繞在臍動脈和臍靜脈周圍并且含水量豐富的膠樣組織，其富含大量且高質量的臍帶間充質干細胞。
6、但是，目前在現有技術背景下，培養臍帶間充質干細胞過程中，為了確保其不被污染添加抗生素，為了提高增殖效率添加含有人源或動物源性血清、同種異體人血清或血漿成分的非臨床級別培養試劑，導致收獲的臍帶間充質干細胞的產量、活率和純度均較低，且不符合臨床級別臍帶間充質干細胞注射液的質量標準要求，可能會對應用者身體帶來負面影響。
技術實現思路
1、本專利技術的目的是針對現有的問題，提供了一種臍帶間充質干細胞的培養基及臍帶間充質干細胞的分離培養方法。
2、本專利技術是通過以下技術方案實現的：
3、一種臍帶間充質干細胞的分離培養方法，包括如下步驟：
4、(1)臍帶組織的清洗：
5、將臍帶放置于生物安全柜內，用無菌的鉤齒鑷取出臍帶，置于提前準備好的含生理鹽水的10cm培養皿中，清洗2～3遍，將組織表面血污清洗干凈，用手術剪將臍帶剪成小段，再放置于含生理鹽水的10cm培養皿中繼續清洗2-3遍；
6、(2)臍帶組織剝離：
7、用無菌剪刀沿靜脈血管平行方向剪開臍帶，再用鉤齒鑷沿剪開的一邊撕掉靜脈膜，然后平攤開臍帶，尋找兩根動脈血管；
8、用鉤齒鑷去除臍帶內2條動脈，剩余部分即為華通氏膠和臍帶表面羊膜，用鉤齒鑷輕輕地剝離華通氏膠，放在25ml玻璃燒杯中，用剪刀剪成1cm2小的組織塊；
9、(3)原代細胞接種：
10、將組織塊用配置好的培養基混懸后接種在10cm培養皿中，每皿約3～4ml即可；
11、晃勻使其均勻地平鋪在地面，放進培養箱培養，記為p0；
12、(4)原代細胞收集：
13、細胞接種第10至12天，觀察皿中mscs細胞生長情況，根據細胞集落的生長情況執行p0～p1傳代操作；
14、棄去上層培養基，用生理鹽水清洗2遍后，用accutase酶液進行消化，收集細胞懸液至50ml離心管中，200g條件下離心5min，收集細胞，收集的細胞用生理鹽水200g?5min洗滌一次；
15、向裝有細胞的50ml離心管中加入預溫的培養基，重懸細胞，根據細胞計數，按照1.0*106cells密度接種在15cm培養皿中，每皿加預溫的培養基至20ml，置于二氧化碳培養箱中培養，記為p1；
16、(5)細胞傳代：
17、每天觀察mscs細胞生長狀況，細胞密度≥85％時進行傳代擴增，執行p1～p2傳代擴增，根據細胞計數，按照1.0*106cells密度接種在15cm培養皿中；
18、(6)細胞凍存：
19、觀察待收集細胞的生長狀態，在細胞密度達到85％以上時，向培養皿中加入生理鹽水，輕輕晃動培養瓶，棄去生理鹽水；
20、向培養瓶或皿中加入accutase，37℃下放置，顯微鏡下觀察細胞消化情況；
21、在細胞大部分脫壁時，收集細胞懸液至50ml離心管中，200g條件下離心5min，收集細胞，離心完成后，棄上清，用50ml生理鹽水重懸細胞，并取樣50ul計數，200g?5min洗滌一次；
22、根據細胞數量，加入適量已經預溫的凍存液，調整細胞懸液密度為2×106/ml，每管1ml，并作標記p2，將細胞放入-80℃冰箱內過夜保存，隔天轉入-196℃液氮中長期保存。
23、(7)細胞計數：
24、p1代細胞收集計數可達到1.5～2.5*108，細胞密度為2×106/ml進行凍存，可凍存70～100支；
25、p2代細胞收集計數可達到7.0～8.0*108，細胞密度為2×106/ml進行凍存，可凍存300～400支；
26、(8)細胞檢測：
27、在細胞凍存前進行細胞表面標志物檢測和干細胞三系分化功能檢測。
28、無菌檢測、活性檢測、純度檢測。
29、所述培養基包括如下組分：基礎培養基、維生素c、維生素e、積雪草提取物、蛋白質纖維、l-甘氨酸、l-精氨酸、酪氨酸、硝酸鑭、硝酸鈰。
30、進一步地，步驟(1)中所述的用手術剪將臍帶剪成3～5cm的小段。
31、進一步地，步驟(4)中所述的傳代操作時細胞密度在85～90％。
32、進一步地，所述基礎培養基為mscbm培養基。
33、進一步地，所述維生素e、維生素c的終濃度相同，均為8.2～10.4μg/l。
34、進一步地，所述積雪草提取物的終濃度為3.6～5.2μg/l。
35、進一步地，所述蛋白質纖維的終濃度為10.3～11.1μg/l。
36、進一步地，所述本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種臍帶間充質干細胞的培養基分離培養方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.根據權利要求1所述一種臍帶間充質干細胞的分離培養方法，其特征在于，步驟(1)中所述的用手術剪將臍帶剪成3～5cm的小段。
3.根據權利要求1所述一種臍帶間充質干細胞的分離培養方法，其特征在于，步驟(4)中所述的傳代操作時細胞密度在85～90％。
4.根據權利要求1所述一種臍帶間充質干細胞的分離培養方法，其特征在于，所述基礎培養基為MSCBM培養基。
5.根據權利要求1所述一種臍帶間充質干細胞的分離培養方法，其特征在于，所述維生素E、維生素C的終濃度相同，均為8.2～10.4μg/L。
6.根據權利要求1所述一種臍帶間充質干細胞的分離培養方法，其特征在于，所述積雪草提取物的終濃度為3.6～5.2μg/L。
7.根據權利要求1所述一種臍帶間充質干細胞的分離培養方法，其特征在于，所述蛋白質纖維的終濃度為10.3～11.1μg/L。
8.根據權利要求1所述一種臍帶間充質干細胞的分離培養方法，其特征在于，所述L-甘氨酸、L-精氨酸
9.根據權利要求1所述一種臍帶間充質干細胞的分離培養方法，其特征在于，所述硝酸鑭、硝酸鈰的終濃度分別為6.3～8.3μg/L、5.1～7.1μg/L。
...【技術特征摘要】
1.一種臍帶間充質干細胞的培養基分離培養方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.根據權利要求1所述一種臍帶間充質干細胞的分離培養方法，其特征在于，步驟(1)中所述的用手術剪將臍帶剪成3～5cm的小段。
3.根據權利要求1所述一種臍帶間充質干細胞的分離培養方法，其特征在于，步驟(4)中所述的傳代操作時細胞密度在85～90％。
4.根據權利要求1所述一種臍帶間充質干細胞的分離培養方法，其特征在于，所述基礎培養基為mscbm培養基。
5.根據權利要求1所述一種臍帶間充質干細胞的分離培養方法，其特征在于，所述維生素e、維生素c的終濃度相同，均為8.2～10.4μg/l。
6....
【專利技術屬性】
技術研發人員：唐曉琳，林子微，
申請(專利權)人：西格曼生物工程長春有限公司，
類型：發明
國別省市：
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