【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于分子生物，具體涉及一種用于多種曲霉菌和念珠菌的rt-pcr檢測試劑盒及其使用方法。
技術介紹
1、呼吸道真菌感染是指真菌侵入人體呼吸道系統，包括鼻腔、咽部、氣管、支氣管和肺部，引起的感染性疾病。這種感染可以是局部的，也可以是全身性的，嚴重時可能導致器官功能障礙甚至死亡。呼吸道真菌感染在全球范圍內是一種重要的公共衛生問題，其流行性情況、每年感染人數和死亡人數具有顯著的地區差異和時間變化。
2、上呼吸道曲霉菌和念珠菌污染和定植十分常見，而真菌定植是發展成為侵入性感染的重要危險因素，在宿主存在易患因素時會導致深部真菌感染。國內資料顯示，綜合醫院住院患者侵襲性真菌病(invasive?fungal?disease，ifi)的發病率為4.12％，感染部位以下呼吸道最多；檢出的真菌種類以念珠菌屬為主，其中白色念珠菌占67.29％，霉菌占6.20％；院內侵襲性念珠菌感染發生率為0.025％～0.074％，病死率高達37.7％。白色念珠菌占院內侵襲性念珠菌感染的首位(57.1％)。近年來，侵襲性曲霉感染發生率也逐漸上升，占所有ifi的5.9％～12.0％，最常見煙曲霉、黃曲霉及黑曲霉。
3、呼吸道真菌感染的檢測對于早期診斷和治療具有重要意義。不同的檢測方法在診斷呼吸道真菌感染中具有不同的特點。目前的檢測方法主要分為以下幾類：真菌培養法、熒光染色法、熒光pcr法、血清學檢測、免疫學檢測方法等。熒光pcr方法以其高靈敏度和特異性、操作簡便、可快速獲取結果等優點越來越受到廣泛的應用。
4、對于真菌檢測
技術實現思路
1、針對
技術介紹
中提到的現有熒光pcr檢測真菌技術中存在靈敏度不足、特異性較差，從而導致無法同時進行多項真菌檢測的問題，對引物和探針進行特異性設計，提高了檢測的靈敏度和特異性。
2、本專利技術的具體技術方案：
3、一種用于多種曲霉菌和念珠菌的rt-pcr檢測試劑盒，所述檢測試劑盒包括試劑i和試劑ii，所述試劑i和試劑ii均包括緩沖溶液、taq酶和用于檢測的引物、探針，所述試劑i用于檢測土曲霉、黑曲霉、煙曲霉和黃曲霉，所述試劑ii用于檢測構巢曲霉、白色念珠菌和耳念珠菌。
4、進一步，所述試劑i中引物包括土曲霉、黑曲霉、煙曲霉和黃曲霉的正向擴增引物：5’-gtccgrtcctcgagcgta+tg-3’，如seq?id?no.1所示；反向擴增引物：5’-atccctacctgatccgag+gtca-3’，如seq?id?no.2所示；
5、所述試劑i探針中包括土曲霉檢測探針：5’-cttcgtcttccgctccg-3’、5’-ctttgtcttccgctctg-3’，如seq?id?no.10、seq?id?no.11所示；
6、黑曲霉檢測探針：5’-acatgctctgtaggattg-3’，如seq?id?no.12所示；
7、黃曲霉檢測探針：5’-cgcttgccgaacgcaaatcaatc-3’，如seq?id?no.13所示；
8、煙曲霉檢測探針：5’-ccagccgacacccaactatttttctaaggt-3’，如seq?id?no.14所示。
9、進一步，所述土曲霉檢測探針序列5’端標記有fam熒光基團，3’端標記有熒光淬滅基團mgb；
10、所述黑曲霉的檢測探針序列5’端標記有vic熒光基團，3’端標記有熒光淬滅基團mgb；
11、所述黃曲霉的檢測探針序列5’端標記有cy5熒光基團，3’端標記有熒光淬滅基團bhq2；
12、所述煙曲霉的檢測探針序列5’端標記有rox熒光基團，3’端標記有熒光淬滅基團bhq2。
13、進一步，所述試劑ii中引物包括構巢曲霉的正向擴增引物：5’-ggcttgtgtgttgggtc+gt-3’，如seq?id?no.3所示；反向擴增引物：5’-gccctaatgagcgggtga+c-3’，如seq?id?no.4所示；
14、白色念珠菌的正向擴增引物：5’-gcttgaaagacggtagtggtaa+gg-3’，如seq?idno.5所示；反向擴增引物：5’-ccgccgcaagcaatg+ttt-3’，如seq?id?no.6所示；
15、耳念珠菌的正向擴增引物：
16、5’-cgatacgtagtatgacttgcaga+cg-3’、
17、5’-gatacgtcgtacgacttgcaga+c-3’，如seq?id?no.7、seq?id?no.8所示；反向擴增引物：5’-accgcgaagattggtgagaagac+at-3’，如seq?id?no.9所示；
18、所述試劑ii探針中包括構巢曲霉檢測探針：5’-accggacacggtgcc-3’，如seq?idno.15所示；
19、白色念珠菌檢測探針：5’-ctaagccattgtcaaagc-3’，如seq?id?no.16所示；
20、耳念珠菌檢測探針：5’-cacattgcgccttggggtattccc-3’，如seq?id?no.17所示。
21、進一步，所述構巢曲霉的檢測探針序列5’端標記有fam熒光基團，3’端標記有熒光淬滅基團mgb；
22、所述白色念珠菌的檢測探針序列5’端標記有vic熒光基團，3’端標記有熒光淬滅基團mgb；
23、所述耳念珠菌的檢測探針序列5’端標記有rox熒光基團，3’端標記有熒光淬滅基團bhq2。
24、進一步，所述引物序列中堿基“a+”、“c+”和“g+”為鎖核酸修飾的堿基。
25、進一步，所述試劑i中，土曲霉、黑曲霉、黃曲霉、煙曲霉引物終濃度為444nm，各指標探針終濃度均為111nm。所述試劑ii中，構巢曲霉、白色念珠菌、耳念珠菌各引物終濃度為444nm，各指標探針終濃度均為222nm。
26、本專利技術還提供一種用于多種曲霉菌和念珠菌的rt-pcr檢測試劑盒的使用方法，包括如下步驟：
27、步驟一：提取樣本核酸
28、步驟二：將試劑i和試劑ii混勻后直接分裝至試管中，再將提取的樣本模版、陰性對照、陽性質控品分別加入至不同的pcr反應管中，設置反應條件反應；
29、步驟三本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種用于多種曲霉菌和念珠菌的RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于：所述檢測試劑盒包括試劑Ⅰ和試劑Ⅱ，所述試劑Ⅰ和試劑Ⅱ均包括緩沖溶液、taq酶和用于檢測的引物、探針，所述試劑Ⅰ用于檢測土曲霉、黑曲霉、煙曲霉和黃曲霉，所述試劑Ⅱ用于檢測構巢曲霉、白色念珠菌和耳念珠菌。
2.根據權利要求1所述的一種用于多種曲霉菌和念珠菌的RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于：所述試劑Ⅰ中引物包括土曲霉、黑曲霉、煙曲霉和黃曲霉的正向擴增引物：5’-GTCCGRTCCTCGAGCGTA+TG-3’，如SEQ?ID?No.1所示；反向擴增引物：5’-ATCCCTACCTGATCCGAG+GTCA-3’，如SEQ?ID?No.2所示；
3.根據權利要求2所述的一種用于多種曲霉菌和念珠菌的RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于：所述土曲霉檢測探針序列5’端標記有FAM熒光基團，3’端標記有熒光淬滅基團MGB；
4.根據權利要求3所述的一種用于多種曲霉菌和念珠菌的RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于：所述試劑Ⅱ中引物包括構巢曲霉的正向擴增引物：5’-?GGCTTGTGTGTTGGG
5.根據權利要求4所述的一種用于多種曲霉菌和念珠菌的RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于：所述構巢曲霉的檢測探針序列5’端標記有FAM熒光基團，3’端標記有熒光淬滅基團MGB；
6.根據權利要求5所述的一種用于多種曲霉菌和念珠菌的RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于：所述引物序列中堿基“A+”、“C+”和“G+”為鎖核酸修飾的堿基。
7.根據權利要求5所述的一種用于多種曲霉菌和念珠菌的RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于：所述試劑Ⅰ中，土曲霉、黑曲霉、黃曲霉、煙曲霉引物終濃度為444nM，各指標探針終濃度均為111nM；所述試劑Ⅱ中構巢曲霉、白色念珠菌、耳念珠菌各引物終濃度為444nM，各指標探針終濃度為222?nM。
8.權利要求1-7中任意一項中所述的一種用于多種曲霉菌和念珠菌的RT-PCR檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，包括如下步驟：
9.根據權利要求8中所述的一種用于多種曲霉菌和念珠菌的RT-PCR檢測試劑盒的使用方法，其特征在于：所述步驟二中反應條件為預變性階段95℃，2min；擴增階段95℃，5s、56℃，30s，循環40次。
...【技術特征摘要】
1.一種用于多種曲霉菌和念珠菌的rt-pcr檢測試劑盒，其特征在于：所述檢測試劑盒包括試劑ⅰ和試劑ⅱ，所述試劑ⅰ和試劑ⅱ均包括緩沖溶液、taq酶和用于檢測的引物、探針，所述試劑ⅰ用于檢測土曲霉、黑曲霉、煙曲霉和黃曲霉，所述試劑ⅱ用于檢測構巢曲霉、白色念珠菌和耳念珠菌。
2.根據權利要求1所述的一種用于多種曲霉菌和念珠菌的rt-pcr檢測試劑盒，其特征在于：所述試劑ⅰ中引物包括土曲霉、黑曲霉、煙曲霉和黃曲霉的正向擴增引物：5’-gtccgrtcctcgagcgta+tg-3’，如seq?id?no.1所示；反向擴增引物：5’-atccctacctgatccgag+gtca-3’，如seq?id?no.2所示；
3.根據權利要求2所述的一種用于多種曲霉菌和念珠菌的rt-pcr檢測試劑盒，其特征在于：所述土曲霉檢測探針序列5’端標記有fam熒光基團，3’端標記有熒光淬滅基團mgb；
4.根據權利要求3所述的一種用于多種曲霉菌和念珠菌的rt-pcr檢測試劑盒，其特征在于：所述試劑ⅱ中引物包括構巢曲霉的正向擴增引物：5’-?ggcttgtgtgttgggtc+gt-3’，如seq?id?no.3所示；反向擴增引物：5’-?gcccta...
【專利技術屬性】
技術研發人員：丁小靜，張倩，楊揚，戴舒雅，
申請(專利權)人：江蘇和創生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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