【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一株產(chǎn)辣椒紅色素的大腸桿菌及其應(yīng)用，屬于基因工程。
技術(shù)介紹
1、辣椒紅色素是從成熟紅辣椒中提取的一類四萜類天然類胡蘿卜素，它被世界糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織列為a類著色劑，也即在烹飪過程中是不限量添加使用的。辣椒紅色素主要由兩種色素組成：辣椒紅素（capsanthin）和辣椒玉紅素（capsorubin），其中辣椒紅素是辣椒紅色素的主要成分。目前，辣椒紅色素已被驗證具有重要的生理活性，例如：減少脂肪吸收，增加脂肪消耗，降低胰島素抵抗，抗結(jié)腸癌，抑制肺癌和三陰性乳腺癌細胞的生長等。總之，辣椒紅色素是一種在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域具有巨大應(yīng)用前景的天然化合物。
2、但是，辣椒紅色素的天然含量很低，僅為1.32‰～1.34‰,占辣椒中總類胡蘿卜素的56.06%～57.14%，其中辣椒紅素平均含量為1.27‰，辣椒玉紅素僅為0.586‰～0.672‰。除了天然含量低外，其酯化形式的生物利用度低，嚴重限制其在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。而且，使用化學(xué)有機試劑提取后的辣椒粕主要是纖維素和半纖維素，因為適口性差，所以很難以禽畜飼料的形式再利用。加之辣椒紅色素的光熱敏感性，使用有機試劑浸提時的設(shè)備要求和溫度要求高。
3、隨著合成生物學(xué)和基因工程等科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，微生物發(fā)酵法逐漸成為生產(chǎn)天然產(chǎn)物的有效途徑。但構(gòu)建產(chǎn)辣椒紅色素的重組工程菌的難點在于：辣椒紅色素的合成途徑復(fù)雜，將合成途徑中所涉及的酶的表達基因均重組到工程菌中需要轉(zhuǎn)化多次，難度大，成功率低；且在轉(zhuǎn)入異源基因使基因工程菌實現(xiàn)產(chǎn)物的合成后，還需要對中間菌株進行多次改造、篩選，
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本專利技術(shù)通過基因工程構(gòu)建了重組工程菌，并篩選得到了一株高產(chǎn)辣椒紅色素的大腸桿菌。本專利技術(shù)還提供了該產(chǎn)辣椒紅色素的大腸桿菌在制備辣椒紅色素中的應(yīng)用。
2、本專利技術(shù)是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
3、一株產(chǎn)辣椒紅色素的大腸桿菌，分類命名為escherichia?coli?cap-ouc-chb，保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為cctcc?no：m?20241969，保藏日期為2024年09月13日。
4、所述產(chǎn)辣椒紅色素的大腸桿菌的生物學(xué)特征為：兼性厭氧型大腸桿菌，37℃時，在lb固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)12?h，菌落呈白色，表面光滑，邊緣整齊。液體發(fā)酵時采用有氧發(fā)酵。
5、所述產(chǎn)辣椒紅色素的大腸桿菌在制備辣椒紅色素中的應(yīng)用。
6、進一步地，所述辣椒紅色素選自辣椒紅素、辣椒玉紅素中的任意一種或兩種。
7、進一步地，具體應(yīng)用時，培養(yǎng)產(chǎn)辣椒紅色素的大腸桿菌，提取得到辣椒紅色素。
8、進一步地，所述培養(yǎng)產(chǎn)辣椒紅色素的大腸桿菌的具體方式可以為：將產(chǎn)辣椒紅色素的大腸桿菌的種子液接種于自誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量2%（體積百分數(shù)），在37℃、220rpm條件下?lián)u床誘導(dǎo)發(fā)酵48～96小時（優(yōu)選72小時）。
9、更進一步地，所述自誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)基選自zyp-5052培養(yǎng)基（現(xiàn)有技術(shù)中已有的商品化培養(yǎng)基）。
10、更進一步地，所述自誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)基中含有20?mm的甲酸鈉；發(fā)酵的第36小時，向發(fā)酵液中添加20?mm的阿拉伯糖進行誘導(dǎo)。
11、進一步地，所述提取得到辣椒紅色素的具體方式可以為：取培養(yǎng)的發(fā)酵液，離心棄上清，向沉淀中加入適量丙酮，萃取，離心，上清液過濾除雜，得到萃取液，萃取液中即含有辣椒紅素和辣椒玉紅素。
12、更進一步地，所述丙酮的添加量為：每10?ml發(fā)酵液添加1?ml丙酮。
13、本專利技術(shù)還提供了一種產(chǎn)辣椒紅色素的重組工程菌的構(gòu)建方法，步驟如下：
14、（1）構(gòu)建產(chǎn)玉米黃質(zhì)的重組大腸桿菌作為底盤細胞：以大腸桿菌e.?coli?bl21（de3）（現(xiàn)有技術(shù)中已有的適合表達外源蛋白的宿主菌株）為出發(fā)菌株，使用基因編輯載體phcy-25a和phcy-26d敲除trxb基因，再以ptrc99a為表達載體，轉(zhuǎn)入crte、crtb、crti、crty和crtz基因，構(gòu)建并篩選得到重組工程菌（每次轉(zhuǎn)化后選擇產(chǎn)量最高的轉(zhuǎn)化子作為下一次轉(zhuǎn)化的宿主，下同）；所述敲除trxb基因使用的靶向trxb的n20的核苷酸序列如seq?id?no.1所示；所述crte、crtb、crti、crty和crtz基因的核苷酸序列依次如seq?id?no.2～6所示；
15、（2）構(gòu)建產(chǎn)紫黃質(zhì)的重組大腸桿菌作為底盤細胞：以prsfduet-1為表達載體，向上述步驟（1）構(gòu)建的重組工程菌中轉(zhuǎn)入zep基因；然后，以ptrc99a-ebiyz為表達載體，轉(zhuǎn)入trx-m1、trx-m2和trx-m4基因，構(gòu)建并篩選得到重組工程菌；所述zep、trx-m1、trx-m2和trx-m4基因的核苷酸序列依次如seq?id?no.8、10、11、12所示；
16、（3）構(gòu)建產(chǎn)辣椒紅素和辣椒玉紅素的重組大腸桿菌：以prsfduet-zep為表達載體，向上述步驟（2）構(gòu)建的重組工程菌中轉(zhuǎn)入5’端連接有支架蛋白spycatcher的ccs基因和5’端連接有spytag的β-cav1基因；然后，以pacycduet-1為表達載體，進一步轉(zhuǎn)入cpn60α，cpn60β和cpn20基因；然后以pcdfduet-1為表達載體，進一步轉(zhuǎn)入fdhm和fre基因，構(gòu)建并篩選得到產(chǎn)辣椒紅素和辣椒玉紅素的重組大腸桿菌；所述spycatcher-ccs，spytag-β-cav1，cpn60α，cpn60β，cpn20，fdhm和fre基因的核苷酸序列依次如seq?id?no.13～19所示。
17、利用上述產(chǎn)辣椒紅色素的重組工程菌的構(gòu)建方法構(gòu)建得到的重組工程菌。
18、本專利技術(shù)的構(gòu)建方法，具有以下有益效果：
19、（1）在產(chǎn)玉米黃質(zhì)的底盤細胞中引入了湖泊紅球藻質(zhì)體來源的玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶zep，通過敲除大腸桿菌基因組上的trxb基因為zep創(chuàng)造了氧化態(tài)的催化環(huán)境，高活性形式的zep可以促進玉米黃質(zhì)轉(zhuǎn)化為花藥黃質(zhì)和紫黃質(zhì)，為下一步合成辣椒紅素和辣椒玉紅素提供充足的前體。
20、（2）辣椒紅素合酶ccs來源于辣椒的葉綠體，本專利技術(shù)使用spy支架蛋白對其進行同源三聚體的組裝，該三聚體模仿了其準(zhǔn)生理狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)，同時引入了辣椒葉綠體來源的分子伴侶cpn60α，cpn60β和cpn20，促進了ccs的折疊。fadh2是ccs必須的輔因子，fdhm可以催化甲酸鈉。
21、本專利技術(shù)的產(chǎn)辣椒紅色素的大腸桿菌，可實現(xiàn)辣椒紅素和辣椒玉紅素的高產(chǎn)（辣椒紅素和辣椒玉紅素的積累量可達6.77?mg/g?dcw和2.18?mg/g?dcw），具有生長繁殖快、產(chǎn)物濃度高、反應(yīng)穩(wěn)定可靠等優(yōu)點，具有工業(yè)化生產(chǎn)的潛力，有著良好的應(yīng)用前景。
22、本專利技術(shù)使用的各種術(shù)語和短語具有本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的一般含義。
本文檔來自技高網(wǎng)...【技術(shù)保護點】
1.一株產(chǎn)辣椒紅色素的大腸桿菌，其特征在于：分類命名為Escherichia?coli?Cap-OUC-CHB，保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC?NO：M?20241969，保藏日期為2024年09月13日。
2.權(quán)利要求1所述的產(chǎn)辣椒紅色素的大腸桿菌在制備辣椒紅色素中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于：所述辣椒紅色素選自辣椒紅素、辣椒玉紅素中的任意一種或兩種。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于：具體應(yīng)用時，培養(yǎng)產(chǎn)辣椒紅色素的大腸桿菌，提取得到辣椒紅色素。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述培養(yǎng)產(chǎn)辣椒紅色素的大腸桿菌的具體方式為：將產(chǎn)辣椒紅色素的大腸桿菌的種子液接種于自誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37℃、220rpm條件下?lián)u床誘導(dǎo)發(fā)酵48～96小時。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于：所述自誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)基選自ZYP-5052培養(yǎng)基；
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述提取得到辣椒紅色素的具體方式為：取培養(yǎng)的發(fā)酵液，離心棄上清，向沉淀中加入丙酮，
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述丙酮的添加量為：每10?mL發(fā)酵液添加1?mL丙酮。
9.一種產(chǎn)辣椒紅色素的重組工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟如下：
10.利用權(quán)利要求9所述的構(gòu)建方法構(gòu)建得到的重組工程菌。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一株產(chǎn)辣椒紅色素的大腸桿菌，其特征在于：分類命名為escherichia?coli?cap-ouc-chb，保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為cctcc?no：m?20241969，保藏日期為2024年09月13日。
2.權(quán)利要求1所述的產(chǎn)辣椒紅色素的大腸桿菌在制備辣椒紅色素中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于：所述辣椒紅色素選自辣椒紅素、辣椒玉紅素中的任意一種或兩種。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于：具體應(yīng)用時，培養(yǎng)產(chǎn)辣椒紅色素的大腸桿菌，提取得到辣椒紅色素。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述培養(yǎng)產(chǎn)辣椒紅色素的大腸桿菌的具體方式為：將產(chǎn)辣椒紅色素的大腸桿菌的種...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：劉振，陳慧彬，郭貴萍，
申請(專利權(quán))人：中國海洋大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：
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