【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及植物基因工程，具體涉及一種蕓薹屬植物葉片原生質體制備和轉化的方法。
技術介紹
1、原生質體瞬時基因表達體系因其操作簡單、轉化周期短、轉化效率高等優點，在植物基因功能研究和遺傳改良中得到了廣泛應用。然而，在蕓薹屬蔬菜作物中，原生質體制備和轉化的效率相對較低。
2、參考申請號為cn201710916783.1的中國專利技術專利，公開了一種油菜原生質體的分離及轉化方法，具體包括以油菜子葉或真葉為原材料，分析影響油菜葉肉原生質體分離及目標基因轉化的主要因素，確定適用于油菜的酶解、分離、純化及轉化的體系，最終以油菜原生質體為受體，利用合適濃度的peg介導，將整合了外源基因的表達載體轉入油菜原生質體中，經過優化培養，使外源基因在油菜原生質體中成功表達。參考申請號為cn201910840640.6的中國專利技術專利，公開了一種大白菜的原生質體制備及遺傳轉化方法，包括從大白菜黃化內葉中得到大白菜原生質體的步驟。
3、參考現有技術存在以下缺點：1、關于蕓薹屬植物原生質體制備和轉化的優化方法公開較少，僅可制備與轉化蕓薹屬下單一植物的原生質體，并不適用于蕓薹屬下所有植物。2、且所選材料必須為實生苗，材料需用膠帶預處理。3、酶解后需用蔗糖溶液純化，實驗條件要求苛刻，操作復雜。
技術實現思路
1、為解決上述技術問題，本專利技術提供一種適用于所有蕓薹屬下植物葉片原生質體制備和轉化的方法，保證實驗材料可快速獲取，實驗操作流程簡便，轉化效率提高。
2、本申請所提供
3、步驟s1：選取1g蕓薹屬下植物(甘藍、油菜、白菜、芥菜、青菜)新鮮健康的葉片，流水沖洗，并用吸水紙擦干，用鋒利刀片平行主葉脈將其切為0.5-1mm條狀；
4、步驟s2：將上述材料置入20ml酶解液中，25-28℃避光酶解，所述的酶解液配方為：0.75wt％纖維素酶，0.2wt％果膠酶，0.6m甘露醇(mannitol)，20mm?kcl，20mm?ph為5.7的mes，10mm?cacl2，0.1wt％bsa；
5、步驟s3：酶解5h后，在酶解混合液中加入等體積w5溶液(4mm?mes，154mm?nacl，125mm?cacl2，5mm?kcl，2mm?mes(ph5.7))離心洗滌原生質體，離心去上清后，用10mlw5溶液重懸原生質體，所得綠色溶液即為純化后的原生質體；
6、步驟s4：將上述綠色溶液置于冰上避光靜置30min；
7、步驟s5：離心去除w5溶液，用mmg溶液(0.4m?mannitol，15mm?mgcl2及4mm?mes(ph5.7))重懸原生質體沉淀，重懸后細胞密度為1.5-2×105細胞/ml，備用；
8、步驟s6：原生質體轉化：轉化體系為10μg質粒，100μl原生質體-mmg懸混液，110μl40％peg-4000，輕柔混勻后，37℃水浴6min，再加入500μl?w5溶液重新懸浮，終止轉化；離心棄上清，加入500μlw5溶液重懸浮，室溫培養12-16h。
9、本專利技術的技術效果和優點：
10、1、本專利技術方法可適用于不同程度的葉片，且無需特殊處理，通過簡便的離心方式，增加了蕓薹屬下不同植物葉片的原生質體轉化效率。
11、2、本專利技術通過改變酶的選擇和用量、酶解緩沖液的配方，以此滿足蕓薹屬下不同植物葉片的原生質體制備需求。通過改變mmg溶液和轉化液配方、轉化方法，以此滿足蕓薹屬下不同植物葉片的原生質體轉化需求。
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1.一種蕓薹屬植物葉片原生質體制備的方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的一種蕓薹屬植物葉片原生質體制備的方法，其特征在于，所述步驟S4具體包括：
3.根據權利要求1所述的一種蕓薹屬植物葉片原生質體制備的方法，其特征在于，所述酶解液的配方為：0.75wt％纖維素酶，0.2wt％果膠酶，0.6M甘露醇，20mM?KCl，20mM?pH為5.7的MES，10mM?CaCl2，0.1wt％BSA。
4.根據權利要求1所述的一種蕓薹屬植物葉片原生質體制備的方法，其特征在于，所述W5溶液的配方為：4mM?MES，154mM?NaCl，125mM?CaCl2，5mM?KCl，2mM?pH為5.7的MES。
5.根據權利要求2所述的一種蕓薹屬植物葉片原生質體制備的方法，其特征在于，所述MMG溶液的配方為：0.4M甘露醇，15mM?MgCl2及4mM?pH為5.7的MES。
6.根據權利要求1所述的一種蕓薹屬植物葉片原生質體制備的方法，其特征在于，所述蕓薹屬下植物包括但不限于甘藍、油菜、白菜、芥菜、青菜。
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