【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一種利用甘薯高效生產(chǎn)蝦青素的轉(zhuǎn)基因育種方法，屬于轉(zhuǎn)基因。
技術(shù)介紹
1、蝦青素是一種脂溶性類酮胡蘿卜素，最初是從龍蝦中分離出來，主要存在于多種藻類、微生物、甲殼類動物及海洋魚類中，在高等植物中鮮有報道。蝦青素含有13個共軛雙鍵，具有極性-非極性-極性交替結(jié)構(gòu)，使其能夠跨越細胞和細胞器膜，因此比玉米黃質(zhì)和葉黃素等表現(xiàn)出更強的抗脂質(zhì)過氧化活性。蝦青素的抗氧化活性可達維生素e的550倍，由于其出色的抗氧化能力和其他生物活性，蝦青素可顯著減少對dna、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的氧化損傷，減少炎癥、延緩衰老、提高免疫力、防治糖尿病和心血管疾病等，已廣泛用于制藥、營養(yǎng)品、化妝品和水產(chǎn)養(yǎng)殖等行業(yè)。隨著蝦青素的營養(yǎng)保健品市場大幅增長，其需求量也大幅增加。化學合成和從微藻雨紅球菌中提取是制備天然蝦青素的主要方法，然而由于其高成本和技術(shù)壁壘，微藻衍生蝦青素在商業(yè)生產(chǎn)中的占比不到1%。同時，合成蝦青素表現(xiàn)出不同的立體化學，可能被副產(chǎn)品污染，這使得它不太適合人類直接食用。因此，利用高等植物尤其是重要農(nóng)作物合成蝦青素是生物強化工程的重要策略。由于植物中富含蝦青素的前體β-類胡蘿卜素，目前利用基因工程手段，已在煙草、番茄、土豆、水稻、玉米、小麥中實現(xiàn)了蝦青素的合成。
2、甘薯是旋花科番薯屬雙子葉植物，俗稱紅薯、番薯、地瓜等，高產(chǎn)高抗且適應性強，因此是重要的糧食和工業(yè)原料作物。甘薯由于積累了不同的天然色素，包括類胡蘿卜素和花青苷等，而使薯肉呈現(xiàn)不同的顏色。然而，甘薯中并沒有蝦青素合成途徑的關(guān)鍵基因，因此無法產(chǎn)生酮類胡蘿卜素。因此，通過甘薯為優(yōu)勢
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)所要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種在甘薯中合成蝦青素的組合基因，重組載體及其在分子育種中的應用。
2、本專利技術(shù)提供了在甘薯種表達產(chǎn)生蝦青素的組合基因及其應用，是在增強型植物超表達載體pcambia1300-dsred2-egfp的 kpni和 spei酶切位點之間連入組合基因 tp- ibor- r96h-2a- tp- shpbhy-2a- tp- crbkt?( obb)，構(gòu)建其重組超表達載體，再基于發(fā)根農(nóng)桿菌的原位轉(zhuǎn)化技術(shù)，將重組超表達載體轉(zhuǎn)入甘薯基因組中，篩選獲得塊根富含蝦青素的轉(zhuǎn)基因甘薯材料。該轉(zhuǎn)基因甘薯植株不僅可以作為生產(chǎn)蝦青素的優(yōu)秀原料，而且還可以成為促進健康的功能性甘薯新種質(zhì)。
3、本專利技術(shù)提供一種蝦青素生物合成組合基因 obb，由能提高類胡蘿卜素的積累的甘薯 ibor-r96h基因、參與蝦青素合成的β-胡蘿卜素羥化酶基因 shpbhy、參與蝦青素合成的β-胡蘿卜素酮化酶基因 crbkt通過編碼可自行切割的2a肽序列依次串聯(lián)組成，所述甘薯 ibor- r96h基因的核苷酸序列如seq?id?no.2所示，所述 shpbhy基因的核苷酸序列如seq?id?no.4所示，所述 crbkt基因的核苷酸序列如seq?id?no.6所示。
4、本專利技術(shù)提供一種蝦青素生物合成組合基因 obb，其組成順序為： tp- ibor-?r96h- 2a- tp- shpbhy-2a- tp- crbkt。甘薯 ibor-r96h基因能提高類胡蘿卜素的積累，雨生紅球藻 shpbhy基因可編碼參與蝦青素合成的β-胡蘿卜素羥化酶，萊茵衣藻 crbkt基因可編碼參與蝦青素合成的β-胡蘿卜素酮化酶。
5、上述的蝦青素生物合成組合基因 obb，所述甘薯 ibor-r96h基因、 shpbhy基因、 crbkt基因的5’端分別與質(zhì)體轉(zhuǎn)運肽tp序列融合，并通過編碼可自行切割的2a肽序列依次串聯(lián)組成至一個開放閱讀框中，所述質(zhì)體轉(zhuǎn)運肽tp的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，所述 2a肽的核苷酸序列如seq?id?no.3和5所示。
6、本專利技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，參與蝦青素合成的組合基因 obb，將其異源表達于甘薯植株中，可顯著地提高蝦青素的積累，對于通過基因工程技術(shù)定向培育富含蝦青素的轉(zhuǎn)基因甘薯新種質(zhì)具有重要意義。
7、本專利技術(shù)還提供了含有參與蝦青素合成的組合基因 obb的增強型重組超表達載體。
8、上述的增強型重組超表達載體，包括分別與含cor47-5′utr翻譯起始增強子序列的2×35s啟動子和hsp-t878終止子融合的 obb基因的表達盒。
9、上述的增強型重組表達載體，是在pcambia1300-dsred2-egfp載體的 kpni和 spei酶切位點之間連入蝦青素生物合成組合基因 obb的核苷酸序列，具體如seq?id?no.1-seqid?no.6所示。
10、本專利技術(shù)提供了含有上述增強型重組表達載體的微生物轉(zhuǎn)化體。
11、上述微生物轉(zhuǎn)化體為發(fā)根農(nóng)桿菌k599。
12、本專利技術(shù)提供了如上述的蝦青素生物合成組合基因 obb在制備轉(zhuǎn)基因甘薯中的應用。
13、本專利技術(shù)進一步提供了如上述的蝦青素生物合成組合基因 obb在甘薯合成蝦青素中的應用。
14、本專利技術(shù)參與蝦青素生物合成的組合基因 obb能夠提高甘薯中蝦青素的合成。將參與蝦青素生物合成的組合基因 obb轉(zhuǎn)入甘薯基因組中，在轉(zhuǎn)基因甘薯中過表達，得到高蝦青素含量的轉(zhuǎn)基因甘薯。 本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
1.一種蝦青素生物合成組合基因OBB，其特征在于，由能提高類胡蘿卜素的積累的甘薯IbOR-R96H基因、參與蝦青素合成的β-胡蘿卜素羥化酶基因sHpBHY、參與蝦青素合成的β-胡蘿卜素酮化酶基因CrBKT通過編碼可自行切割的2A肽序列依次串聯(lián)組成，所述甘薯IbOR-R96H基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示，所述sHpBHY基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.4所示，所述CrBKT基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.6所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蝦青素生物合成組合基因OBB，其特征在于，所述甘薯IbOR-R96H基因、sHpBHY基因、CrBKT基因的5’端分別與質(zhì)體轉(zhuǎn)運肽TP序列融合，并通過編碼可自行切割的2A肽序列依次串聯(lián)組成至一個開放閱讀框中，所述質(zhì)體轉(zhuǎn)運肽TP的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，所述2A肽的核苷酸序列如SEQ?ID?No.3和5所示。
3.含有參與蝦青素合成的組合基因OBB的增強型重組超表達載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的增強型重組超表達載體，其特征在于，包括分別與含COR47-5′UTR翻譯起始
5.?根據(jù)權(quán)利要求4所述的增強型重組表達載體，其特征在于，所述增強型重組表達載體是在pCAMBIA1300-DsRed2-eGFP載體的Kpn?I和Spe?I酶切位點之間連入蝦青素生物合成組合基因OBB的核苷酸序列。
6.含有如權(quán)利要求3至5任一項所述增強型重組表達載體的微生物轉(zhuǎn)化體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的微生物轉(zhuǎn)化體，其特征在于，所述微生物轉(zhuǎn)化體為發(fā)根農(nóng)桿菌K599。
8.如權(quán)利要求1所述的蝦青素生物合成組合基因OBB在制備轉(zhuǎn)基因甘薯中的應用。
9.如權(quán)利要求1所述的蝦青素生物合成組合基因OBB在甘薯合成蝦青素中的應用。
10.一種在轉(zhuǎn)基因甘薯中合成蝦青素的分子育種方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)基因材料的構(gòu)建方法為：組合共表達蝦青素合成的三個基因，包括IbOR-R96H基因、sHpBHY基因和CrBKT基因，三個基因的5’端分別與質(zhì)體轉(zhuǎn)運肽TP序列融合，并通過編碼可自行切割的2A肽序列依次串聯(lián)組成至一個開放閱讀框中，構(gòu)建其增強型重組超表達載體，轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌后并通過遺傳轉(zhuǎn)化獲得富含蝦青素的轉(zhuǎn)基因甘薯。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種蝦青素生物合成組合基因obb，其特征在于，由能提高類胡蘿卜素的積累的甘薯ibor-r96h基因、參與蝦青素合成的β-胡蘿卜素羥化酶基因shpbhy、參與蝦青素合成的β-胡蘿卜素酮化酶基因crbkt通過編碼可自行切割的2a肽序列依次串聯(lián)組成，所述甘薯ibor-r96h基因的核苷酸序列如seq?id?no.2所示，所述shpbhy基因的核苷酸序列如seq?id?no.4所示，所述crbkt基因的核苷酸序列如seq?id?no.6所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蝦青素生物合成組合基因obb，其特征在于，所述甘薯ibor-r96h基因、shpbhy基因、crbkt基因的5’端分別與質(zhì)體轉(zhuǎn)運肽tp序列融合，并通過編碼可自行切割的2a肽序列依次串聯(lián)組成至一個開放閱讀框中，所述質(zhì)體轉(zhuǎn)運肽tp的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，所述2a肽的核苷酸序列如seq?id?no.3和5所示。
3.含有參與蝦青素合成的組合基因obb的增強型重組超表達載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的增強型重組超表達載體，其特征在于，包括分別與含cor47-5′utr翻譯起始增強子序列的2×35s啟動子和hsp...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：朱明庫，劉維威，孟小慶，呂雨蒙，王藝霏，于婧，洪海婷，黃燦，李非凡，
申請(專利權(quán))人：江蘇師范大學，
類型：發(fā)明
國別省市：
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