【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于分子生物學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，具體地，涉及一種定量組合物、試劑盒、方法及用途，更具體地，涉及一種病原體的定量組合物、試劑盒、方法及用途。
技術(shù)介紹
1、核酸定量檢測(cè)對(duì)確診病原體感染和評(píng)估感染之后的治療效果具有十分重要的作用，通過定量檢測(cè)技術(shù)可以了解機(jī)體內(nèi)病原體的數(shù)量、復(fù)制水平、傳染性、藥物治療效果、制定治療策略等，并將其作為評(píng)估指標(biāo)，也是唯一能幫助確診隱匿性感染和隱匿性慢性感染（例如hbv、hcv，以及hiv等）的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)。
2、很多病原體在潛伏期、急性期或慢性期，都具有傳染性。大多數(shù)的其余檢測(cè)并不能作為病原體是否復(fù)制的指標(biāo)，而核酸檢測(cè)通過擴(kuò)增病原體核酸，對(duì)體內(nèi)低水平的病原體很敏感，是判斷病原體復(fù)制的常用手段。
3、因此，本領(lǐng)域?qū)Σ≡w，特別地，低載量的病原體的精確定量檢測(cè)，即超高靈敏定量檢測(cè)是具有需求的。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、有鑒于此，第一方面，本專利技術(shù)提供了一種定量組合物，包括：
2、第一試劑，包括n組引物和探針，其中，所述n組引物和探針分別用于擴(kuò)增并檢測(cè)病原體的n個(gè)區(qū)段x1~xn；
3、第二試劑，包括n個(gè)同源載體，其中，所述同源載體包括所述病原體的區(qū)段，所述病原體的區(qū)段分別與第一試劑中所述病原體的區(qū)段x1~xn一一對(duì)應(yīng)；
4、第三試劑，包括m個(gè)定量載體；以及
5、第四試劑，包括m組引物和探針，其中，所述m組引物和探針分別用于擴(kuò)增并檢測(cè)所述定量載體的區(qū)段；
6、其中，n和m均為≥1的正
7、本專利技術(shù)創(chuàng)造性地引入了同源載體，人為增大樣本中病原體的濃度，進(jìn)而提高pcr擴(kuò)增反應(yīng)的穩(wěn)定性與精確性。特別地，在低載量的病原體樣本中，更能夠更準(zhǔn)確的檢出。同時(shí)，如果引入2個(gè)或2個(gè)以上的同源載體，會(huì)更有助于突變多的病原體（例如rna病毒）的定量，從而防止錯(cuò)檢。
8、進(jìn)一步地，所述n≥m。
9、進(jìn)一步地，所述n為1~100中任意的正整數(shù)、1~50中任意的正整數(shù)、1~20中任意的正整數(shù)、1~10中任意的正整數(shù)。
10、在一些具體的實(shí)施方案中，n可以為1、2、3、4、5、6等。
11、舉例地，當(dāng)n為1時(shí)，第一試劑包括1組引物和探針，其擴(kuò)增病原體的區(qū)段x1；相應(yīng)地，第二試劑包括1個(gè)同源載體，包括病原體的區(qū)段x1。
12、舉例地，當(dāng)n為2時(shí)，第一試劑包括2組引物和探針，其可以分別擴(kuò)增病原體的區(qū)段x1和x2；相應(yīng)地，第二試劑包括2個(gè)同源載體，一個(gè)同源載體包括病原體的區(qū)段x1，一個(gè)同源載體包括病原體的區(qū)段x2。
13、舉例地，當(dāng)n為3時(shí)，第一試劑包括3組引物和探針，其可以分別擴(kuò)增病原體的區(qū)段x1、x2和x3；相應(yīng)地，第二試劑包括3個(gè)同源載體，一個(gè)同源載體包括病原體的區(qū)段x1，一個(gè)同源載體包括病原體的區(qū)段x2，一個(gè)同源載體包括病原體的區(qū)段x3。
14、進(jìn)一步地，所述m為1~100中任意的正整數(shù)、1~50中任意的正整數(shù)、1~20中任意的正整數(shù)、1~10中任意的正整數(shù)。
15、在一些具體的實(shí)施方案中，m可以為1、2、3、4、5、6等。舉例地，m的取值在第三試劑和第四試劑中的情況與上述n的取值的時(shí)候，第一試劑和第二試劑的情況類似，不再贅述。
16、進(jìn)一步地，所述x1~xn是針對(duì)不同的病原體靶區(qū)確定的；更進(jìn)一步地，所述病原體靶區(qū)可以是病原體的保守區(qū)域，例如，hbv的c、s、p、x區(qū)，這些區(qū)域高度保守，存在1個(gè)靶區(qū)域，即n=1，即可以完成定量；當(dāng)n=2及以上時(shí)，其自然也能滿足定量。
17、更進(jìn)一步地，所述病原體靶區(qū)可以是病原體的非保守區(qū)域，例如，hiv的pol、gag、ltr區(qū)，這些區(qū)域高度變異，存在至少3個(gè)靶區(qū)域，即n=3，可以確保完成定量而不漏檢，當(dāng)n＞3時(shí)，其自然也能滿足定量，誠然，當(dāng)n=1或2時(shí)，其可能存在漏檢，但仍然不影響其相比現(xiàn)有技術(shù)能夠更精準(zhǔn)的定量檢測(cè)病原體。
18、進(jìn)一步地，所述病原體可以是細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲。例如細(xì)菌：糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、傷寒沙門菌、副傷寒沙門菌；病毒：腸道病毒71型、星狀病毒、諾如病毒、輪狀病毒、腸道腺病毒；寄生蟲：致病性多房棘球絳蟲與細(xì)粒棘球絳蟲真菌：黃曲霉等。
19、進(jìn)一步地，所述病原體的核酸可以是dna，或rna。例如，所述病原體可以是dna病毒也可以是rna病毒。例如，本專利技術(shù)的病原體可以是乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒等。
20、進(jìn)一步地，所述病原體可以相同或不同。
21、更進(jìn)一步地，所述病原體相同，即第一試劑和/或第二試劑中所述病原體的區(qū)段屬于同一病原體中的不同區(qū)段。
22、進(jìn)一步地，所述定量載體可以是現(xiàn)有技術(shù)使用的任何用于定量的載體，其只要不會(huì)在pcr體系中干擾對(duì)應(yīng)病原體的擴(kuò)增即可。例如，可以是含有g(shù)apdh，rnase基因片段等的載體。
23、進(jìn)一步地，所述定量載體可以是針對(duì)所述同源載體中病原體區(qū)段xn的核苷酸序列改造，將原序列中的腺嘌呤脫氧核糖核苷酸（a）替換為胸腺嘧啶脫氧核糖核苷酸（t），將原序列中的胸腺嘧啶脫氧核糖核苷酸（t）替換為腺嘌呤脫氧核糖核苷酸（a）。
24、通過這樣的設(shè)計(jì)，目的是確保定量載體的靶區(qū)段擴(kuò)增效率與同源載體的靶區(qū)段擴(kuò)增效率相似，有效的簡(jiǎn)化了基于定量載體定值計(jì)算同源載體的靶區(qū)段濃度的過程。
25、在本專利技術(shù)中，術(shù)語“載體”指本領(lǐng)域所有能夠裝載核酸的物質(zhì)，并且能夠用于核酸擴(kuò)增的過程，例如，常見的載體有質(zhì)粒、包含有質(zhì)粒的重組病毒（慢病毒、腺病毒、假病毒等）、包含有質(zhì)粒的脂質(zhì)體、人工染色體等。
26、在本專利技術(shù)中，術(shù)語“組”是指檢測(cè)一個(gè)靶點(diǎn)的互相匹配的至少一條上游引物、至少一條下游引物，和至少一條探針。具體地，例如，可以是檢測(cè)一個(gè)靶點(diǎn)的互相匹配的一條上游引物、一條下游引物，和一條探針；也可以是檢測(cè)一個(gè)靶點(diǎn)的互相匹配的兩條上游引物、一條下游引物，和一條探針；也可以是檢測(cè)一個(gè)靶點(diǎn)的互相匹配的一條上游引物、兩條下游引物，和一條探針；也可以是檢測(cè)一個(gè)靶點(diǎn)的互相匹配的一條上游引物、一條下游引物，和兩條探針等情況。
27、在一些具體的實(shí)施方案中，所述載體可以是質(zhì)粒。
28、進(jìn)一步地，所述同源質(zhì)粒和定量質(zhì)粒的骨架質(zhì)粒來源為現(xiàn)有技術(shù)當(dāng)中的任何質(zhì)粒，舉例地，例如puc57質(zhì)粒、pbluescript?ii?sk+質(zhì)粒、puc-sp質(zhì)粒等，其用于承載靶區(qū)段，例如x1、x2和/或x3等。
29、在一些具體的實(shí)施方案中，所述同源質(zhì)粒和定量質(zhì)粒的骨架質(zhì)粒為puc57質(zhì)粒，即將x1的序列合成之后整合于puc57質(zhì)粒上形成同源質(zhì)粒；將x1的a替換為t，t替換a之后的序列合成之后整合于puc57質(zhì)粒上形成定量質(zhì)粒。
30、在一些具體的實(shí)施方案中，所述載體可以是包括上述質(zhì)粒的重組病毒。
31、在一些具體的實(shí)施方案中，所述載體可以是包括上述質(zhì)粒的脂質(zhì)體。
32、在一些具體的實(shí)施方案中，所述載體可以是承本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種定量組合物，包括：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量組合物，其特征在于，所述N為1~10中任意的正整數(shù)，和/或所述M為1~10中任意的正整數(shù)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量組合物，其特征在于，所述定量載體包括針對(duì)所述同源載體中病原體區(qū)段X1~XN改造的核苷酸序列，將同源載體序列中的腺嘌呤脫氧核糖核苷酸替換為胸腺嘧啶脫氧核糖核苷酸，以及將同源載體序列中的胸腺嘧啶脫氧核糖核苷酸替換為腺嘌呤脫氧核糖核苷酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量組合物，其特征在于，所述組合物還包括第五試劑，所述第五試劑包括引物和探針，其中，第五試劑中所述引物和探針用于擴(kuò)增并檢測(cè)病原體的區(qū)段，其中，第五試劑擴(kuò)增的病原體的區(qū)段與第一試劑擴(kuò)增的病原體的區(qū)段和第二試劑中的病原體的區(qū)段不同。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量組合物，其特征在于，所述組合物還包括第六試劑以及第七試劑；
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量組合物，其特征在于，所述定量組合物包括下列組合物中的任意一種：
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量組合物，其特征在于，所述載體為質(zhì)粒、包含有質(zhì)粒的重
8.根據(jù)權(quán)利要求1~7中任一項(xiàng)所述的定量組合物，其特征在于，所述同源載體的濃度為最低定量濃度的25%~66.7%。
9.根據(jù)權(quán)利要求1~8中任一項(xiàng)所述的定量組合物用于制備定量試劑盒的用途。
10.一種定量試劑盒，包括如權(quán)利要求1~8中任一項(xiàng)所述的組合物。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括核酸擴(kuò)增試劑、核酸釋放試劑，或核酸提取試劑中的至少一種。
12.一種非診斷目的的定量方法，所述方法包括以下步驟：
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述定量的公式為：
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種定量組合物，包括：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量組合物，其特征在于，所述n為1~10中任意的正整數(shù)，和/或所述m為1~10中任意的正整數(shù)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量組合物，其特征在于，所述定量載體包括針對(duì)所述同源載體中病原體區(qū)段x1~xn改造的核苷酸序列，將同源載體序列中的腺嘌呤脫氧核糖核苷酸替換為胸腺嘧啶脫氧核糖核苷酸，以及將同源載體序列中的胸腺嘧啶脫氧核糖核苷酸替換為腺嘌呤脫氧核糖核苷酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量組合物，其特征在于，所述組合物還包括第五試劑，所述第五試劑包括引物和探針，其中，第五試劑中所述引物和探針用于擴(kuò)增并檢測(cè)病原體的區(qū)段，其中，第五試劑擴(kuò)增的病原體的區(qū)段與第一試劑擴(kuò)增的病原體的區(qū)段和第二試劑中的病原體的區(qū)段不同。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量組合物，其特征在于，所述組合物還包括第六試劑以及第七試劑；
...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：戴立忠，吳康，丁峰，彭坤堅(jiān)，肖天鈺，楊柳，殷勤，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：圣湘生物科技股份有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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