【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及生物，具體而言，涉及一種特異性抗牛鏈球菌igy抗體的制備方法及應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、牛鏈球菌群（streptococcus?bovis?group,?sbsec）是一類表現(xiàn)為非溶血性或α-溶血性的革蘭氏陽(yáng)性鏈球菌，有多樣化的種和亞種，是鏈球菌中的一個(gè)重要類群。牛鏈球菌與多種疾病關(guān)系密切且危害嚴(yán)重。有研究表明，對(duì)于人類而言，牛鏈球菌是感染性心內(nèi)膜炎、菌血癥的重要致病菌之一，其中約?18%?-?62%?的牛鏈球菌心內(nèi)膜炎患者伴有結(jié)直腸腫瘤，約?25%?-?80%?的牛鏈球菌菌血癥患者同時(shí)患有結(jié)直腸腫瘤。這些疾病不僅可能導(dǎo)致患者出現(xiàn)發(fā)熱、疼痛、乏力等不適癥狀，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，當(dāng)結(jié)直腸癌患者合并牛鏈球菌感染時(shí)，甚至?xí)又夭∏椋绊懩[瘤的治療效果和患者的預(yù)后，危及生命。對(duì)于動(dòng)物而言（尤其是牛），牛鏈球菌不僅可引起感染性心內(nèi)膜炎、菌血癥，還可引起其他部位的感染，如腦膜炎、腹膜炎、關(guān)節(jié)炎、膽囊炎、膽管炎等，嚴(yán)重影響動(dòng)物健康與養(yǎng)殖效益。值得注意的是，動(dòng)物經(jīng)牛鏈球菌感染后有極大可能通過(guò)食物鏈對(duì)人類健康構(gòu)成威脅。
2、目前，對(duì)于牛鏈球菌的感染主要采用抗生素進(jìn)行治療，然而傳統(tǒng)的抗生素治療方式在未獲得藥敏試驗(yàn)結(jié)果前存在不確定性，經(jīng)驗(yàn)性用藥可能因菌株耐藥導(dǎo)致治療失敗并加重耐藥情況；而依據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果用藥又可能錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)間，給養(yǎng)殖場(chǎng)帶來(lái)經(jīng)濟(jì)損失。另一方面，抗生素本身的廣泛應(yīng)用帶來(lái)諸多危害，如菌群失衡、過(guò)敏反應(yīng)和細(xì)菌耐藥性加速發(fā)展等。因此，在應(yīng)對(duì)牛鏈球菌感染時(shí)，迫切需要在合理使用抗生素的基礎(chǔ)上，積極開(kāi)發(fā)新型抗菌藥物及替代
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本申請(qǐng)的第一目的在于提供一種特異性抗牛鏈球菌igy抗體的制備方法，運(yùn)用構(gòu)建牛鏈球菌多表位抗原真核表達(dá)載體對(duì)產(chǎn)蛋雞進(jìn)行dna免疫，使產(chǎn)蛋雞產(chǎn)生高效價(jià)且特異殺牛鏈球菌的抗體（抗crr-igy），有效克服傳統(tǒng)抗生素治療牛鏈球菌感染易引發(fā)耐藥性和光譜殺菌引起菌群紊亂問(wèn)題，為靶向治療、消毒殺滅牛鏈球菌提供新材料制備新方法。
2、本申請(qǐng)的第二目的在于提供一種特異性抗牛鏈球菌igy抗體特異殺菌液。
3、本申請(qǐng)的第三目的在于提供一種特異性抗牛鏈球菌igy抗體生物消毒液。
4、本申請(qǐng)的第四目的在于提供一種特異性抗牛鏈球菌igy抗體飼料。
5、以上應(yīng)用用于預(yù)防和治療牛鏈球菌感染，減少耐藥菌產(chǎn)生，解決抗生素治療在牛鏈球菌感染中面臨的耐藥性問(wèn)題、菌群失衡風(fēng)險(xiǎn)以及對(duì)機(jī)體造成額外負(fù)擔(dān)等缺陷，其創(chuàng)新之處在于針對(duì)不同應(yīng)用場(chǎng)景（環(huán)境消殺、飼料添加、疾病治療）設(shè)計(jì)并形成了相應(yīng)產(chǎn)品。
6、為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本申請(qǐng)采用的技術(shù)方案為：
7、第一方面，本申請(qǐng)實(shí)施例提供一種特異性抗牛鏈球菌igy抗體的制備方法，其包括以下步驟：s1.牛鏈球菌多表位抗原的設(shè)計(jì)與合成，包括以下步驟：①.靶蛋白選擇與表位篩選，以牛鏈球菌的桿狀決定蛋白（roda）為靶蛋白，獲取氨基酸和基因序列，進(jìn)行t、b細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表位預(yù)測(cè)篩選，將篩選出的表位序列串聯(lián)兩次增強(qiáng)免疫原性，在c端連接黏膜免疫佐劑ctb基因序列，得到融合蛋白序列ctb-roda-roda（crr）；②.序列優(yōu)化與合成，在所述crr序列的5′端引入bamh?i酶切位點(diǎn)，3′端引入ecor?i酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基序列，依據(jù)禽類的密碼子偏好性對(duì)基因序列進(jìn)行優(yōu)化，合成得到長(zhǎng)度為1080bp、理論分子量約四十多kd的crr基因片段；s2.重組質(zhì)粒pvax1-crr的構(gòu)建，包括以下步驟：1）.雙酶切反應(yīng)，取所述crr基因片段和真核表達(dá)載體pvax1，分別用bamh?i和ecor?i進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，得到反應(yīng)液；2）.酶切產(chǎn)物純化，將所述反應(yīng)液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切下目的條帶，并使用膠回收試劑盒回收純化目的dna片段；3）.連接反應(yīng)，將所述純化目的dna片段放入無(wú)菌的微量離心管中配制連接反應(yīng)體系，混勻后離心并置于16℃下連接過(guò)夜，得到連接產(chǎn)物；4）.轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，取e.colidh5α感受態(tài)細(xì)胞，加入所述連接產(chǎn)物，混合冰浴30min，42℃熱激90s，迅速轉(zhuǎn)移至冰上冷卻2min，加入到lb液體培養(yǎng)基中，在37℃下，200rpm振蕩培養(yǎng)1h，使菌群復(fù)蘇，將復(fù)蘇后的菌液涂布于含有卡那霉素的lb固體培養(yǎng)基平板上，37℃下倒置培養(yǎng)過(guò)夜得到菌落；5）.菌落pcr鑒定，取所述菌落在含有卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基培養(yǎng)后進(jìn)行pcr擴(kuò)增，的到pcr產(chǎn)物，將所述pcr產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，若出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的條帶，則初步判斷為陽(yáng)性克隆；6）.酶切鑒定，從所述陽(yáng)性克隆中提取質(zhì)粒，用bamh?i和ecor?i進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，得到酶切產(chǎn)物，將所述酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，若出現(xiàn)預(yù)期大小的條帶，則進(jìn)一步表明重組質(zhì)粒pvax1-crr構(gòu)建成功；7）.測(cè)序鑒定，將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒pvax1-crr進(jìn)行dna測(cè)序，測(cè)序引物為pvax1載體上的通用引物，將測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)的crr序列進(jìn)行比對(duì)分析，若序列完全一致，則證實(shí)重組質(zhì)粒pvax1-crr構(gòu)建正確，得到重組質(zhì)粒pvax1-crr；s3.抗體制備，包括以下步驟：i.選擇產(chǎn)蛋雞，以ctb為免疫佐劑設(shè)計(jì)免疫程序，并用重組質(zhì)粒pvax1-crr對(duì)所述產(chǎn)蛋雞進(jìn)行免疫；ii.選取收集的雞蛋，取出蛋黃液冷凍備用；iii.將所述蛋黃進(jìn)行水溶性組分提取，得到含igy的水溶性組分（wsf）；iv.將所述水溶性組分進(jìn)行分離和純化，得到igy沉淀物；v.將所述igy沉淀物進(jìn)行透析，得到特異性抗牛鏈球菌igy抗體。
8、與哺乳動(dòng)物的igg相比，特異性抗牛鏈球菌igy具有價(jià)廉易得、穩(wěn)定性好、產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)。與傳統(tǒng)抗生素相比，特異性抗牛鏈球菌igy具有高度特異性，能夠精確識(shí)別并結(jié)合牛鏈球菌表面的特定抗原，有效減少了抗生素治療中常見(jiàn)的消化道不適和二重感染；其次，igy抗體具有良好的穩(wěn)定性和較長(zhǎng)的半衰期，在一定的溫度、ph?值等條件下仍能保持活性，可以在體內(nèi)持續(xù)發(fā)揮作用；不僅如此，igy抗體還具有免疫調(diào)節(jié)作用，有著直接中和牛鏈球菌的能力，與機(jī)體免疫系統(tǒng)相互協(xié)作，為動(dòng)物提供更為持久的保護(hù)；最重要的是，使用igy抗體可以有效避免抗生素耐藥性的發(fā)展，由于igy抗體的作用機(jī)制不同于抗生素，不會(huì)誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，這有效抑制了耐藥菌株的出現(xiàn)，有助于維護(hù)全球公共衛(wèi)生的穩(wěn)定。
9、在本申請(qǐng)中創(chuàng)造性地對(duì)牛鏈球菌多表位抗原進(jìn)行設(shè)計(jì)和合成，將篩選出的表位序列串聯(lián)兩次以增強(qiáng)免疫原性，并在串聯(lián)表位序列的c端連接黏膜免疫佐劑ctb基因序列，為后續(xù)對(duì)產(chǎn)蛋雞使用ctb作為免疫佐劑免疫打下基礎(chǔ)，?同時(shí)依據(jù)禽類的密碼子偏好性對(duì)基因序列進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)1080bp序列進(jìn)行了在雞上表達(dá)的優(yōu)化，為后續(xù)crr-igy抗體的制備提供基礎(chǔ)。
10、使用構(gòu)建牛鏈球菌多表位抗原真核表達(dá)載體對(duì)蛋雞進(jìn)行?dna?免疫來(lái)獲得特異性抗牛鏈?igy?有諸多優(yōu)點(diǎn)：一是具有高效免疫原性誘導(dǎo)能力，能夠充分激活免疫，產(chǎn)生大量高親和力的特異性抗體；二是生產(chǎn)過(guò)程簡(jiǎn)便且穩(wěn)定，省略本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種特異性抗牛鏈球菌IgY抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種特異性抗牛鏈球菌IgY抗體的制備方法，其特征在于，所述步驟I中，以CTB為免疫佐劑設(shè)計(jì)的免疫程序具體為：免疫前注射600μg的CTB；7-9天時(shí)進(jìn)行第一次免疫，注射150μl的牛鏈球菌（sp）；14-21天時(shí)進(jìn)行第二次免疫，注射150μl的牛鏈球菌（sp）；28-52天時(shí)進(jìn)行第三次免疫，注射150μl的牛鏈球菌（sp）；62-72天時(shí)進(jìn)行第四次免疫，注射150μl的牛鏈球菌（sp）。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種特異性抗牛鏈球菌IgY抗體的制備方法，其特征在于，所述步驟I中，采用翅根部皮下及胸部肌肉多點(diǎn)注射法進(jìn)行免疫。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種特異性抗牛鏈球菌IgY抗體的制備方法，其特征在于，所述步驟II中的具體方法為：選取收集的雞蛋，用0.1%濃度的新潔爾滅溶液浸泡30min，取出晾干，使用蛋黃分離器將蛋黃取出，刺破所述蛋黃的蛋黃膜取出蛋黃液，將所述蛋黃液放入-80℃冰箱中冷凍2h，轉(zhuǎn)移至4℃冰箱中冷藏過(guò)夜，使其回溫。
5.根
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種特異性抗牛鏈球菌IgY抗體的制備方法，其特征在于，所述步驟IV的具體方法為：將所述水溶性組分置于離心管中，加入飽和硫酸銨溶液，攪拌使硫酸銨的終飽和度為50%，置入4℃冰箱中靜置3h，再放入離心機(jī)中，設(shè)置轉(zhuǎn)速3000rpm，溫度4℃下離心20min，棄去上清液，加入超純水和飽和硫酸銨溶液，攪拌使硫酸銨的終飽和度為33%，置入4℃冰箱中靜置3h，放入離心機(jī)中，設(shè)置轉(zhuǎn)速3000rpm，溫度4℃下離心20min，棄去上清液，得到IgY沉淀物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種特異性抗牛鏈球菌IgY抗體的制備方法，其特征在于，所述步驟V的具體方法為：將所述IgY沉淀物裝入透析袋中進(jìn)行透析，使用萘氏試劑檢測(cè)透析外液是否有黃色，使用1%濃度的BaCl2溶液檢測(cè)透析外液是否有沉淀，當(dāng)透析外液無(wú)黃色且無(wú)沉淀時(shí)，表明透析完成，得到特異性抗牛鏈球菌IgY抗體。
8.一種特異性抗牛鏈球菌IgY抗體特異殺菌液，其特征在于，所述特異殺菌液的原料包括權(quán)利要求1所述的制備方法制備得到的特異性抗牛鏈球菌IgY抗體。
9.一種特異性抗牛鏈球菌IgY抗體生物消毒液，其特征在于，所述生物消毒液的原料包括權(quán)利要求1所述的制備方法制備得到的特異性抗牛鏈球菌IgY抗體。
10.一種特異性抗牛鏈球菌IgY抗體飼料，其特征在于，所述飼料的原料包括權(quán)利要求1所述的制備方法制備得到的特異性抗牛鏈球菌IgY抗體。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種特異性抗牛鏈球菌igy抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種特異性抗牛鏈球菌igy抗體的制備方法，其特征在于，所述步驟i中，以ctb為免疫佐劑設(shè)計(jì)的免疫程序具體為：免疫前注射600μg的ctb；7-9天時(shí)進(jìn)行第一次免疫，注射150μl的牛鏈球菌（sp）；14-21天時(shí)進(jìn)行第二次免疫，注射150μl的牛鏈球菌（sp）；28-52天時(shí)進(jìn)行第三次免疫，注射150μl的牛鏈球菌（sp）；62-72天時(shí)進(jìn)行第四次免疫，注射150μl的牛鏈球菌（sp）。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種特異性抗牛鏈球菌igy抗體的制備方法，其特征在于，所述步驟i中，采用翅根部皮下及胸部肌肉多點(diǎn)注射法進(jìn)行免疫。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種特異性抗牛鏈球菌igy抗體的制備方法，其特征在于，所述步驟ii中的具體方法為：選取收集的雞蛋，用0.1%濃度的新潔爾滅溶液浸泡30min，取出晾干，使用蛋黃分離器將蛋黃取出，刺破所述蛋黃的蛋黃膜取出蛋黃液，將所述蛋黃液放入-80℃冰箱中冷凍2h，轉(zhuǎn)移至4℃冰箱中冷藏過(guò)夜，使其回溫。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種特異性抗牛鏈球菌igy抗體的制備方法，其特征在于，所述步驟iii的具體方法為：將所述蛋黃液置入ph為5.2的超純水中混合均勻，得到蛋黃懸濁液；將所述蛋黃懸濁液放入4℃冰箱中靜置10h，置入離心機(jī)中，設(shè)置轉(zhuǎn)速10000rpm、溫度4℃下離心25min，離心后上清液即為含ig...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王保寧，鄭璨璘，粱鴿，符立發(fā)，唐智慧，索朗斯珠，黃家艷，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：四川大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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