【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及模式動物疾病模型的構建方法，尤其涉及新生兒先天性消化道梗阻斑馬魚模型的建立方法。
技術介紹
1、新生兒先天性消化道梗阻是在胎兒發育過程中由于多種因素引發的消化系統結構畸形，其發病率在1/10000至1/4000之間。根據梗阻發病位置的不同，可分為食管閉鎖或狹窄、十二指腸閉鎖或狹窄、空腸或回腸閉鎖或狹窄、肛門直腸畸形等幾種常見類型。先天性消化道梗阻典型的臨床特征是消化道不通，表現為嘔吐、腹脹、吞咽困難和無正常胎便排出等。除了消化道解剖結構的異常，此類患者還可能伴有消化道動力功能障礙。盡管手術治療是目前唯一公認的有效方法，但術后可能出現感染、粘連、吻合口瘺等嚴重不良反應。
2、先天性消化道梗阻的病因和發病機制至今尚未完全闡明。遺傳因素、環境暴露、激素水平變化等因素都可能與此類疾病的發生相關。早期的研究提出了腸空泡化不全、胚胎晚期腸系膜血運障礙、腸壁內神經和起搏器細胞發育不全等學說，但都不能對疾病的發生作出完整解釋。隨著胚胎學、免疫學和遺傳學等學科的深入研究，越來越多的證據表明消化道畸形的形成與遺傳因素密不可分，多種基因參與其發生和發展。
3、zic3基因位于人類第x號染色體，負責編碼鋅指蛋白家族成員之一的鋅指蛋白3（zincfingerprotein3）。研究表明，zic3基因的突變或功能不全與身體左右對稱性的建立紊亂密切相關（例如心臟、腸道和其他內臟器官的位置異常），這種紊亂尤其在心臟發育缺陷中表現顯著。gebbia等人在1997年的研究中首次揭示了zic3基因突變與左右軸發育異常的關聯。有趣
4、本研究利用crispr/cas9系統構建 zic3斑馬魚系，通過對突變體消化道畸形的結構和病理分析描述突變魚系的發病情況。
技術實現思路
1、新生兒先天性消化道梗阻斑馬魚模型的建立方法，其特征在于，包括下列步驟：
2、s1、將grna靶點序列設計在斑馬魚 zic3基因的氨基酸結構域上，sgrna具體序列為gcgccataaggttccgtacgagg-3或者gcccccggaccatggtgtgtggg，合成引物；
3、s2、以pmd19- gata5_grna?scaffold載體為模板，使用步驟s1中的引物制備grna體外轉錄模板；
4、s3、將步驟s2的grna體外轉錄模板進行體外轉錄、純化回收獲得grna；
5、s4、將步驟s3回收獲得grna和cas9?mrna新鮮混合后顯微注射入單細胞期斑馬魚胚胎，每個靶點注射180～220枚；
6、s5、收集步驟s4注射入單細胞期斑馬魚胚胎完成72小時后的斑馬魚胚胎，提取基因組，pcr擴增目標片段，測序，測序結果為雙峰的注射批次胚胎進入飼養系統，飼養待性成熟時通過篩選其下一代胚胎檢測有效突變類型斑馬魚，從而獲得 zic3突變斑馬魚。
7、s6、取步驟s5的 zic3突變斑馬魚進行 zic3表達量檢測；
8、s7、取步驟s5的 zic3突變斑馬魚，胚胎完成6天時的 zic3突變斑馬魚進行魚消化道蠕動實時活體熒光成像檢查；
9、s8、取步驟s5的 zic3突變斑馬魚，胚胎完成7天時的 zic3突變斑馬魚進行病理分析；
10、s9、通過對步驟s6、步驟s7、步驟s8獲得數據進行分析描述 zic3突變斑馬魚的發病情況。
11、對于上述模型建立的步驟進行進一步的優化，具體如下：
12、所述步驟s1中sgrna優選選用具體序列gcgccataaggttccgtacgagg-3。
13、所述步驟s1中將grna靶點序列設計在斑馬魚 zic3基因的氨基酸結構域。
14、所述s4中grna和cas9?mrna新鮮混合后顯微注射入單細胞期斑馬魚胚胎，grna為320ng/μl,cas9?mrna為800ng/μl。
15、所述步驟s5中測序結果為雙峰的注射批次胚胎進入飼養系統，飼養待性成熟時通過篩選其下一代胚胎檢測有效突變類型斑馬魚。
16、所述步驟s7中熒光顯微鏡觀察狀況方法：取步驟s5中 zic3突變斑馬魚選擇6dpf的斑馬魚幼魚并將其置于6板孔中進行染色。向每孔中加入4ml斑馬魚培養養殖水，然后加入染料，使最終濃度達到1mg/l。染色24小時后，使用斑馬魚培養養殖水進行3次洗滌，并在洗滌后使用低熔點膠固定樣本，最后使用體視顯微鏡進行拍照。
17、所述步驟s7中 zic3突變斑馬魚幼魚進行病理分析：將 zic3突變斑馬魚幼魚投入4%多聚甲醛固定48h，并依次進行脫水、透明、浸蠟、包埋。切片時切片厚度為4μm，he染色，明場顯微鏡觀察消化道病理情況。
18、所述 zic3突變斑馬魚幼魚為發育到6-7天大。
19、本專利技術的有益效果：本專利技術基于在線crispr靶點設計工具chopchop平臺對靶點進行設計，根據pam序列、gc含量、特異性評分等因素，提供最適合的靶點選擇。將grna和cas9mrna新鮮混合顯微注射，收集了注射后72小時胚胎，pcr擴增目標片段后測序，結果顯示crispant純合基因型斑馬魚有雙峰出現，說明本次設計的crispr/cas9系統起作用，本專利技術所建立的 zic3突變斑馬魚系最終通過步驟s6-s9的檢測分析后，可以模擬新生兒先天性消化道梗阻疾病特征。
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1.新生兒先天性消化道梗阻斑馬魚模型的建立方法，其特征在于，包括下列步驟：
2.如權利要求1所述的新生兒先天性消化道梗阻斑馬魚模型的建立方法，其特征在于：所述步驟S1中sgRNA選用具體序列GCGCCATAAGGTTCCGTACGAGG-3。
3.如權利要求2所述的新生兒先天性消化道梗阻斑馬魚模型的建立方法，其特征在于，還包括如下步驟：
4.如權利要求3所述的新生兒先天性消化道梗阻斑馬魚模型的建立方法，其特征在于：所述步驟S1中將gRNA靶點序列設計在斑馬魚ZIC3基因的氨基酸結構域。
5.如權利要求3所述的新生兒先天性消化道梗阻斑馬魚模型的建立方法，其特征在于：所述S4中gRNA和Cas9?mRNA新鮮混合后顯微注射入單細胞期斑馬魚胚胎，gRNA為320ng/μL,Cas9?mRNA為800ng/μL。
6.如權利要求3所述的新生兒先天性消化道梗阻斑馬魚模型的建立方法，其特征在于，所述步驟S5中測序結果為雙峰的注射批次胚胎進入飼養系統，飼養待性成熟時通過篩選其下一代胚胎檢測有效突變類型斑馬魚。
7.如權利要
8.如權利要求7所述的新生兒先天性消化道梗阻斑馬魚模型的建立方法，其特征在于，所述步驟S7中ZIC3突變斑馬魚幼魚進行病理分析：將ZIC3突變斑馬魚幼魚投入4%多聚甲醛固定48h，并依次進行脫水、透明、浸蠟、包埋，切片時切片厚度為4μm，HE染色，明場顯微鏡觀察消化道病理情況。
9.如權利要求8所述的新生兒先天性消化道梗阻斑馬魚模型的建立方法，其特征在于：所述ZIC3突變斑馬魚幼魚為發育到6-7天大。
...【技術特征摘要】
1.新生兒先天性消化道梗阻斑馬魚模型的建立方法，其特征在于，包括下列步驟：
2.如權利要求1所述的新生兒先天性消化道梗阻斑馬魚模型的建立方法，其特征在于：所述步驟s1中sgrna選用具體序列gcgccataaggttccgtacgagg-3。
3.如權利要求2所述的新生兒先天性消化道梗阻斑馬魚模型的建立方法，其特征在于，還包括如下步驟：
4.如權利要求3所述的新生兒先天性消化道梗阻斑馬魚模型的建立方法，其特征在于：所述步驟s1中將grna靶點序列設計在斑馬魚zic3基因的氨基酸結構域。
5.如權利要求3所述的新生兒先天性消化道梗阻斑馬魚模型的建立方法，其特征在于：所述s4中grna和cas9?mrna新鮮混合后顯微注射入單細胞期斑馬魚胚胎，grna為320ng/μl,cas9?mrna為800ng/μl。
6.如權利要求3所述的新生兒先天性消化道梗阻斑馬魚模型的建立方法，其特征在于，所述步驟s5中測序結果為雙峰的注射批次胚胎進入飼養...
【專利技術屬性】
技術研發人員：黃秀峰，夏雨寒，伍逸清，
申請(專利權)人：溫州醫科大學附屬第二醫院溫州醫科大學附屬育英兒童醫院，
類型：發明
國別省市：
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