【技術實現步驟摘要】
【國外來華專利技術】
本公開涉及一種新型硫醇還原劑及其制備方法和用途。該硫醇還原劑可用于抗體修飾。
技術介紹
1、本節中的陳述僅提供與本專利技術相關的背景信息，并不一定構成現有技術。
2、抗體藥物偶聯物(adc)是一種創新型生物制藥產品，通過合適的連接子將單克隆抗體與小分子藥物連接，將強效的細胞毒性藥物遞送至表達抗原的細胞，adc理想地結合了抗體的特異性和細胞毒性藥物的高效力，從而增強其靶向細胞毒性活性。
3、一般而言，抗體與細胞毒性試劑的偶聯通常包括直接與治療性igg(免疫球蛋白g)抗體上的裸露殘基(包括賴氨酸)偶聯，或者還原鏈間二硫鍵以暴露半胱氨酸殘基偶聯。除此之外還有其他新發展起來的方法將偶聯位點引入到mab，例如位點特異性聚糖偶聯、半胱氨酸工程改造、引入非天然氨基酸以及在藥物-連接子上增加短肽標簽。抗體上通常存在80個賴氨酸殘基；然而，可以通過化學方式進行偶聯的殘基不到10個。半胱氨酸偶聯最多可以實現四個鏈間二硫鍵的還原。這些鍵在特定條件下被還原，隨后產生兩個、四個、六個或八個暴露的巰基。cys偶聯方法和lys偶聯方法兩者都會產生異質混合物。(“advances?andlimitations?of?antibody?drug?conjugates?for?cancer”(用于癌癥的抗體藥物偶聯物的進展和局限性)《生物醫藥》(biomedicines)。2021年8月；9(8):872.)。
4、藥物抗體比(dar)或與單個抗體偶聯的藥物分子的數目對于決定adc的藥效非常重要。dar值變化范圍很大而且取決于其
5、目前已經開發出許多種方法來提高adc的均一性。例如，genentech的thiomab技術就是基于通過抗體工程提高adc的均一性而開發的，通過在抗體的一級序列中引入半胱氨酸，實現位點特異性偶聯來提高產品的均一性(“cysteine-based?coupling:challengesand?solutions”(基于半胱氨酸的耦合：挑戰與解決方案)。《生物共軛化學》(bioconjugchem.)。2021年8月18日；32(8):1525-1534.)。
6、us20210040145公開了一種由14個氨基酸組成的短肽tub-tag，可應用于任何poi的c末端，并能催化各種不同酪氨酸衍生物的加成。tub-tag技術利用微管蛋白酪氨酸連接酶將功能化的組分連接抗體的c末端，從而均一地生成dar2型抗體偶聯物。
7、然而，這些技術都需要蛋白質工程和/或酶催化，因此這些技術存在一些缺點，諸如抗體表達水平較低、免疫原性風險、純化過程復雜和/或成本較高。
8、在均一性得到提升后，抗體藥物偶聯物可以獲得更好的穩定性和更低的免疫原性等益處，并在治療中進一步帶來獲益，例如更好的療效和更低的毒性。因此，開發新型還原劑以及高均一性adc的制備工藝是迫切需求，也是長期目標。
技術實現思路
1、為了上述目的，本文提供了一種具有下式(i)的還原劑：
2、
3、或其鹽、溶劑化物、立體異構體，其特征在于，
4、r1為h、-nh2、-c(o)(r3r4)、任選取代的c1-c5烷基、任選取代的c1-c5羥烷基、或任選取代的芳基；
5、r3為n、nh或o；
6、r4為h、任選取代的c1-c5烷基、任選取代的c1-c5羥烷基、或任選取代的芳基；
7、r2為h、任選取代的c1-c5烷基、或任選取代的c1-c5羥烷基；
8、x為oh、任選取代的c1-c5烷氧基或-nr5r6，
9、r5和r6各自獨立地為h、c0-c5羥烷基、任選取代的c1-c5烷基、任選取代的c2-c8羧基烷基、任選取代的c1-c5烷氧基、任選取代的雜芳烷基、任選取代的芳基烷氧基、任選取代的芳烷基、任選取代的芳基、c1-c5烷基磺酰基、或-(ch2)n1(och2ch2o)n2ch(r8)co(r7)，
10、r7為c0-c5羥烷基、-nhoh，
11、r8為h、任選取代的芳烷基，
12、n1和n2各自獨立地為數字0、1、2、3、4，
13、y與x相同，或y為x的酯或酰胺，
14、z與x或y相同，或
15、y和z各自獨立地選自：
16、
17、x、y和z不同時為
18、在一個方面中，本文提供了一種組合物，其包含上述還原劑和過渡金屬離子。過渡金屬離子為zn2+、cd2+、hg2+、ni2+、co2+或其組合。
19、在一個方面中，本文提供了一種制備上述還原劑的方法，其特征在于，通過在惰性氣氛下引入縮合試劑，將至少一個x’連接到式ii的化合物上，
20、
21、r1為h、-nh2、-c(o)(r3r4)、任選取代的c1-c5烷基、任選取代的c1-c5羥烷基、或任選取代的芳基；
22、r3為n、nh或o；
23、r4為h、任選取代的c1-c5烷基、任選取代的c1-c5羥烷基、或任選取代的芳基；
24、r2為h、任選取代的c1-c5烷基、或任選取代的c1-c5羥烷基；
25、x’為任選取代的c1-c5烷基醇或nr5r6，
26、r5和r6各自獨立地為h、c0-c5羥烷基、任選取代的c1-c5烷基、任選取代的c2-c8羧基烷基、任選取代的c1-c5烷氧基、任選取代的雜芳烷基、任選取代的芳基烷氧基、任選取代的芳烷基、任選取代的芳基、c1-c5烷基磺酰基、或-(ch2)n1(och2ch2o)n2ch(r8)co(r7)，
27、r7為c0-c5羥烷基、-nhoh，
28、r8為h、任選取代的芳烷基，
29、n1和n2獨立地為數字0、1、2、3、4，
30、y與x相同，或y為x的酯或酰胺，
31、z與x或y相同，或
32、y和z各自獨立地選自：
33、
34、在一個方面中，本文提供了上述還原劑或上述組合物在抗體鏈間二硫鍵的還原方面的用途。
35、在一個方面中，本文提供了一種具有位點特異性修飾的抗體的制備方法，包括以下步驟：
36、(a1)在緩沖體系中，將上述還原劑(作為第一還原劑)和過渡金屬離子與抗體共孵育，以選擇性地還原抗體內的鏈間二本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種具有下式(I)的還原劑：
2.如權利要求1所述的還原劑，其特征在于，
3.如權利要求1所述的還原劑，其特征在于，
4.如權利要求1或2所述的還原劑，其特征在于，
5.如權利要求4所述的還原劑，其特征在于，
6.如權利要求1或2所述的還原劑，其特征在于，
7.如權利要求1或2所述的還原劑，其特征在于，
8.如權利要求7所述的還原劑，其特征在于，
9.如權利要求7所述的還原劑，其特征在于，
10.如權利要求1或2所述的還原劑，其特征在于，
11.如權利要求10所述的還原劑，其特征在于，
12.如權利要求1或2所述的還原劑，其特征在于，
13.如權利要求1-12中任一項所述的還原劑，其特征在于，所述還原劑選自：
14.一種組合物，其包含權利要求1-13中任一項所述的還原劑和過渡金屬離子。
15.如權利要求14所述的組合物，其特征在于，所述過渡金屬離子為Zn2+、Cd2+、Hg2+、Ni2+、Co2+或其組合；視情
16.如權利要求14或15所述的組合物，其特征在于，所述過渡金屬離子和所述第一還原劑的摩爾比為0.05:1至40:1；視情況，所述過渡金屬離子和所述第一還原劑的摩爾比可為0.25:1至30:1；視情況；所述過渡金屬離子和所述第一還原劑的摩爾比進一步可為0.25:1至15:1。
17.一種方法，用于制備權利要求1-13中任一項所述的還原劑，其特征在于，通過在惰性氣氛下引入縮合試劑，將至少一個X’與式II的化合物連接，
18.如權利要求17所述的方法，其特征在于，所述式II的化合物為
19.如權利要求17所述的方法，其特征在于，所述X’為2-苯氧基-乙胺、苯胺、芐胺、4-氨基苯-1,2-二醇、5-氨基-2-羥基苯甲酸、雙(吡啶-2-基甲基)胺、5-氨基-8-羥基喹啉、雙(吡啶-2-基)甲胺、4-氨基鄰苯二甲酸、L-酪氨酸叔丁酯、DL-3-(4-氟苯基)丙氨酸、DL-4-氰基苯丙氨酸、DL-4-硝基苯丙氨酸、N-芐羥胺鹽酸鹽、N-苯基羥胺、
20.如權利要求1-13中任一項所述的還原劑或權利要求14-16中任一項所述的組合物在還原抗體的鏈間二硫鍵方面的用途。
21.如權利要求20所述的用途，其特征在于，在制備具有位點特異性修飾的抗體方面，視情況，所述具有位點特異性修飾的抗體可為抗體藥物偶聯物(ADC)；視情況，所述ADC進一步可為具有D2的ADC、具有D4的ADC、具有D1的ADC、具有D6的ADC、具有D3的ADC、具有D1+D6的ADC、具有D1+D2的ADC、具有D1+D4的ADC、具有D2+D4的ADC、具有D6+D2的ADC、具有D6+D1的ADC、具有D3+D1的ADC、具有D3+D2的ADC、具有D0+D6的ADC、或具有D0+D2的ADC。
22.一種方法，用于制備具有位點特異性修飾的抗體，包括以下步驟：
23.如權利要求22所述的方法，其特征在于，所述抗體的Fab區中的兩個鏈間二硫鍵和所述抗體的鉸鏈區中的一個鏈間二硫鍵被還原。
24.如權利要求22所述的方法，其特征在于，所述方法還包括以下步驟：
25.如權利要求24所述的方法，其特征在于，所述方法還包括以下步驟：
26.如權利要求22-24中任一項所述的方法，其特征在于，所述方法還包括以下步驟：
27.如權利要求26所述的方法，其特征在于，所述方法還包括以下步驟：
28.如權利要求26或27所述的方法，其特征在于，所述第一硫代-橋接試劑和所述第二硫代-橋接試劑獨立地含有至少兩個取代基團，以便對硫醇基團進行再橋接。
29.如權利要求28所述的方法，其特征在于，所述第一硫代-橋接試劑和所述第二硫代-橋接試劑各自獨立地選自：
30.如權利要求22、25和27中任一項所述的方法，其特征在于，步驟(A1)、(A3)和(B2)中的所述還原劑與所述抗體的摩爾比各自獨立地為1:1至20、1:1至5:1、1:1至3:1、1:1至2:1或3:1至5:1。
31.如權利要求30所述的方法，其特征在于，步驟(A1)中的所述第一還原劑與所述抗體的摩爾比為2.8:1至13:1，視情況，所述第一還原劑與所述抗體的摩爾比為3.5:1至5:1、4:1至10:1或5:1至13:1。
32.如權利要求22、25和27中任一項所述的方法，其特征在于，步驟(A1)、(A3)和(B2)中的所述...
【技術特征摘要】
【國外來華專利技術】
1.一種具有下式(i)的還原劑：
2.如權利要求1所述的還原劑，其特征在于，
3.如權利要求1所述的還原劑，其特征在于，
4.如權利要求1或2所述的還原劑，其特征在于，
5.如權利要求4所述的還原劑，其特征在于，
6.如權利要求1或2所述的還原劑，其特征在于，
7.如權利要求1或2所述的還原劑，其特征在于，
8.如權利要求7所述的還原劑，其特征在于，
9.如權利要求7所述的還原劑，其特征在于，
10.如權利要求1或2所述的還原劑，其特征在于，
11.如權利要求10所述的還原劑，其特征在于，
12.如權利要求1或2所述的還原劑，其特征在于，
13.如權利要求1-12中任一項所述的還原劑，其特征在于，所述還原劑選自：
14.一種組合物，其包含權利要求1-13中任一項所述的還原劑和過渡金屬離子。
15.如權利要求14所述的組合物，其特征在于，所述過渡金屬離子為zn2+、cd2+、hg2+、ni2+、co2+或其組合；視情況，所述過渡金屬離子為zn2+。
16.如權利要求14或15所述的組合物，其特征在于，所述過渡金屬離子和所述第一還原劑的摩爾比為0.05:1至40:1；視情況，所述過渡金屬離子和所述第一還原劑的摩爾比可為0.25:1至30:1；視情況；所述過渡金屬離子和所述第一還原劑的摩爾比進一步可為0.25:1至15:1。
17.一種方法，用于制備權利要求1-13中任一項所述的還原劑，其特征在于，通過在惰性氣氛下引入縮合試劑，將至少一個x’與式ii的化合物連接，
18.如權利要求17所述的方法，其特征在于，所述式ii的化合物為
19.如權利要求17所述的方法，其特征在于，所述x’為2-苯氧基-乙胺、苯胺、芐胺、4-氨基苯-1,2-二醇、5-氨基-2-羥基苯甲酸、雙(吡啶-2-基甲基)胺、5-氨基-8-羥基喹啉、雙(吡啶-2-基)甲胺、4-氨基鄰苯二甲酸、l-酪氨酸叔丁酯、dl-3-(4-氟苯基)丙氨酸、dl-4-氰基苯丙氨酸、dl-4-硝基苯丙氨酸、n-芐羥胺鹽酸鹽、n-苯基羥胺、
20.如權利要求1-13中任一項所述的還原劑或權利要求14-16中任一項所述的組合物在還原抗體的鏈間二硫鍵方面的用途。
21.如權利要求20所述的用途，其特征在于，在制備具有位點特異性修飾的抗體方面，視情況，所述具有位點特異性修飾的抗體可為抗體藥物偶聯物(adc)；視情況，所述adc進一步可為具有d2的adc、具有d4的adc、具有d1的adc、具有d6的adc、具有d3的adc、具有d1+d6的adc、具有d1+d2的adc、具有d1+d4的adc、具有d2+d4的adc、具有d6+d2的adc、具有d6+d1的adc、具有d3+d1的adc、具有d3+d2的adc、具有d0+d6的adc、或具有d0+d2的adc。
22.一種方法，用于制備具有位點特異性修飾的抗體，包括以下步驟：
23.如權利要求22所述的方法，其特征在于，所述抗體的fab區中的兩個鏈間二硫鍵和所述抗體的鉸鏈區中的一個鏈間二硫鍵被還原。
24.如權利要求22所述的方法，其特征在于，所述方法還包括以下步驟：
25.如權利要求24所述的方法，其特征在于，所述方法還包括以下步驟：
26.如權利要求22-24中任一項所述的方法，其特征在于，所述方法還包括以下步驟：
27.如權利要求26所述的方法，其特征在于，所述方法還包括以下步驟：
28.如權利要求26或27所述的方法，其特征在于，所述第一硫代-橋接試劑和所述第二硫代-橋接試劑獨立地含有至少兩個取代基團，以便對硫醇基團進行再橋接。
29.如權利要求28所述的方法，其特征在于，所述第一硫代-橋接試劑和所述第二硫代-橋接試劑各自獨立地選自：
30.如權利要求22、25和27中任一項所述的方法，其特征在于，步驟(a1)、(a3)和(b2)中的所述還原劑與所述抗體的摩爾比各自獨立地為1:1至20、1:1至5:1、1:1至3:1、1:1至2:1或3:1至5:1。
31.如權利要求30所述的方法，其特征在于，步驟(a1)中的所述第一還原劑與所述抗體的摩爾比為2.8:1至13:1，視情況，所述第一還原劑與所述抗體的摩爾比為3.5:1至5:1、4:1至10:1或5:1至13:1。
32.如權利要求22、25和27中任一項所述的方法，其特征在于，步驟(a1)、(a3)和(b2)中的所述孵育溫度各自獨立地為0℃至37℃、0℃至25℃、0℃至15℃、0℃至10℃、或0℃至5℃。
33.如權利要求22、25和27中任一項所述的方法，其特征在于，步驟(a1)中的所述孵育時間為2小時至24小時、14小時至24小時、16小時至20小時、或16小時至18小時；
34.如權利要求33所述的方法，其特征在于，在步驟(a1)中，所述第一還原劑與所述抗體的摩爾比為4:1至10:1，所述孵育時間為1小時至16小時。
35.如權利要求33所述的方法，其特征在于，在步驟(a1)中，所述第一還原劑與所述抗體的摩爾比為6:1至13:1，所述孵育時間為4小時至16小時。
36.如權利要求33所述的方法，其特征在于，在步驟(a1)中，所述第一還原劑與所述抗體的摩爾比為2...
【專利技術屬性】
技術研發人員：吳麗麗，吉傲，賀文旭，王義成，石鈺，冉亞軍，
申請(專利權)人：蘇州佰睿壹生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：
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