【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及細胞，特別涉及一種高活性腸道隱窩及其分離方法和應用。
技術介紹
1、腸道是哺乳動物營養物質吸收的主要部位和最大的免疫器官。腸道上皮平均3～5天更新一次，是成年哺乳動物自我更新速度最快的組織。小腸黏膜上皮組織主要由腸絨毛-隱窩構成，絨毛上皮細胞根據功能可主要分為：吸收型腸細胞、分泌型腸細胞、杯狀細胞和簇狀細胞等；隱窩細胞根據功能及分化程度可主要分為：腸道干細胞、潘式細胞、祖細胞和過渡擴增細胞等。傳統用于腸道生理病理研究的模型是由某單一種類細胞構成的，如caco-2和ipec-j2細胞系。然而，傳統的單一細胞模型無法做到真實模擬腸道的結構、形態、功能等，嚴重限制了腸道營養、疾病和遺傳調控的研究。近年來，腸道3d類器官的發展為腸道健康研究提供了一個新的模型。類器官(organoids)來源于干細胞或器官祖細胞，是利用干細胞增殖分化的特性進行體外3d培養后形成的細胞團。類器官與來源器官的關系緊密，具有來源器官的三維細胞結構，可重現來源器官的部分功能與空間構架，可真實地反映腸道內的生理和病理過程。目前進行原代腸道類器官培養的方式主要以分離宿主腸道隱窩培養為主。
2、由于不同物種之間的腸道結構具有相似性，各物種的腸道隱窩提取方法均有研究者進行探究。值得注意的是，各研究者提取分離腸道類器官的方法各不相同，其關鍵在于組織消化液使用的不同。目前主流的分離方法主要以傳統的edta法和膠原酶法為主。其中edta法解離細胞的基本原理是通過螯合作用去除細胞表面的金屬離子，從而破壞細胞間的連接，使細胞能夠被分離出來。這種方法對細胞
技術實現思路
1、本專利技術的主要目的是提出一種高活性腸道隱窩及其分離方法和應用，旨在提高腸道隱窩細胞的活率。
2、為實現上述目的，本專利技術提出一種高活性腸道隱窩的分離方法，包括以下步驟：
3、s1.取新鮮腸道，洗凈內容物后刮取黏膜層組織，得腸道黏膜組織；
4、s2.剪碎所述腸道黏膜組織，清洗后與分離液混合，消化解離，得腸道黏膜組織消化液；
5、s3.將所述腸黏膜組織消化液離心后，去掉上清液與保護液混合，得腸道隱窩混合液，過濾、離心，取沉淀物，得高活性腸道隱窩；
6、其中，所述分離液包括膠原酶ⅰ、膠原酶ⅱ、膠原酶ⅳ、彈性蛋白酶、dna酶ⅰ及rock抑制劑；
7、所述保護液包括rpmi1640培養基、抗生素、胎牛血清、牛血清白蛋白及rock抑制劑。
8、在一實施例中，所述分離液中，所述rock抑制劑為rock抑制劑y27632；
9、所述膠原酶ⅰ的質量濃度為0.3～0.7mg/ml；
10、所述膠原酶ⅱ的質量濃度為0.3～0.7mg/ml；
11、所述膠原酶ⅳ的質量濃度為0.8～1.2mg/ml；
12、所述彈性蛋白酶的質量濃度為0.3～0.7mg/ml；
13、所述dna酶ⅰ的質量濃度為0.01～0.2mg/ml；
14、所述rock抑制劑的摩爾濃度為8～12μm。
15、在一實施例中，所述保護液中，所述抗生素包括青霉素和/或鏈霉素，所述rock抑制劑為rock抑制劑y27632；
16、所述抗生素的質量占比為0.5％～1.5％；
17、所述胎牛血清的質量占比為8％～12％；
18、所述牛血清白蛋白的質量占比為0.5％～1.5％；
19、所述rock抑制劑的摩爾濃度為8～12μm。
20、在一實施例中，步驟s2中，剪碎腸道黏膜層組織時，將腸道黏膜層組織剪成直徑為1～3mm的碎片；和/或，
21、消化解離時，邊振蕩邊消化解離，振蕩速度為150～200rpm，消化解離的溫度為36～38℃，消化解離的時長為10～15min。
22、在一實施例中，步驟s3中，將腸黏膜組織消化液離心時，離心的溫度為2～8℃，離心力為200g，離心時長為2～4min；和/或，
23、過濾前，對所述腸道隱窩混合液進行吹打，吹打次數為15～20次。
24、在一實施例中，步驟s3中，過濾包括以下步驟：
25、將腸道隱窩混合液用70μm細胞過濾器過濾，濾液記為第一餾分；
26、將第一餾分使用40μm細胞過濾器過濾，濾液記為第二餾分，截留物記為第三餾分；
27、使用所述保護液反向沖洗細胞過濾器并收集第三餾分后離心，取沉淀物，得高活性腸道隱窩。
28、本專利技術還提出一種高活性腸道隱窩，包括按如前述的高活性腸道隱窩的分離方法所分離得到的高活性腸道隱窩。
29、本專利技術還提出一種腸道隱窩在腸道類器官的培養中的應用，所述腸道隱窩包括如前述的高活性腸道隱窩。
30、本專利技術還提出一種腸道隱窩在腸道黏膜上皮細胞的流式分離中的應用，所述腸道隱窩包括如前述的高活性腸道隱窩。
31、本專利技術還提出一種腸道隱窩在腸道黏膜上皮細胞的單細胞轉錄組學測序中的應用，所述腸道隱窩包括如前述的高活性腸道隱窩。
32、在本專利技術的技術方案中，通過采用膠原酶ⅰ、膠原酶ⅱ、膠原酶ⅳ、彈性蛋白酶、dna酶ⅰ及rock抑制劑作為分離液，其中，膠原酶ⅰ、膠原酶ⅱ、膠原酶ⅳ和彈性蛋白酶可分解細胞間的骨架結構，從而將黏膜組織分離成單個細胞或細胞團塊；rock抑制劑主要通過抑制rock的激酶活性來抑制細胞凋亡，促進細胞的存活，顯著減少解離誘導的細胞凋亡；通過采用rpmi1640培養基、抗生素、胎牛血清、牛血清白蛋白及rock抑制劑作為保護液，其中，抗生素用于預防或控制微生物的生長，從而避免細胞培養物受到污染，胎牛血清和牛血清白蛋白作為蛋白穩定劑，可以結合并中和溶液中的自由基和其他潛在有害物質，從而保護細胞免受損傷，并且，胎牛血清中含有豐富的營養物質，包括氨基酸、維生素、激素、礦物質以及脂類等，能夠維持細胞的生長環境，rock抑制劑通過抑制rock激酶活性，顯著減少解離誘導的細胞凋亡。
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1.一種高活性腸道隱窩的分離方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.如權利要求1所述的高活性腸道隱窩的分離方法，其特征在于，所述分離液中，所述ROCK抑制劑為ROCK抑制劑Y27632；
3.如權利要求1所述的高活性腸道隱窩的分離方法，其特征在于，所述保護液中，所述抗生素包括青霉素和/或鏈霉素，所述ROCK抑制劑為ROCK抑制劑Y27632；
4.如權利要求1所述的高活性腸道隱窩的分離方法，其特征在于，步驟S2中，剪碎腸道黏膜層組織時，將腸道黏膜層組織剪成直徑為1～3mm的碎片；和/或，
5.如權利要求1所述的高活性腸道隱窩的分離方法，其特征在于，步驟S3中，將腸黏膜組織消化液離心時，離心的溫度為2～8℃，離心力為200g，離心時長為2～4min；和/或，
6.如權利要求1所述的高活性腸道隱窩的分離方法，其特征在于，步驟S3中，過濾包括以下步驟：
7.一種高活性腸道隱窩，其特征在于，包括按如權利要求1至6任一項所述的高活性腸道隱窩的分離方法所分離得到的高活性腸道隱窩。
8.一種腸道隱窩在腸道類器官的
9.一種腸道隱窩在腸道黏膜上皮細胞的流式分離中的應用，其特征在于，所述腸道隱窩包括如權利要求7所述的高活性腸道隱窩。
10.一種腸道隱窩在腸道黏膜上皮細胞的單細胞轉錄組學測序中的應用，其特征在于，所述腸道隱窩包括如權利要求7所述的高活性腸道隱窩。
...【技術特征摘要】
1.一種高活性腸道隱窩的分離方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.如權利要求1所述的高活性腸道隱窩的分離方法，其特征在于，所述分離液中，所述rock抑制劑為rock抑制劑y27632；
3.如權利要求1所述的高活性腸道隱窩的分離方法，其特征在于，所述保護液中，所述抗生素包括青霉素和/或鏈霉素，所述rock抑制劑為rock抑制劑y27632；
4.如權利要求1所述的高活性腸道隱窩的分離方法，其特征在于，步驟s2中，剪碎腸道黏膜層組織時，將腸道黏膜層組織剪成直徑為1～3mm的碎片；和/或，
5.如權利要求1所述的高活性腸道隱窩的分離方法，其特征在于，步驟s3中，將腸黏膜組織消化液離心時，離心的溫度為2～8℃，離心力為20...
【專利技術屬性】
技術研發人員：何流琴，何羿文，黃樂，李鐵軍，印遇龍，
申請(專利權)人：湖南師范大學，
類型：發明
國別省市：
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