【技術實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術涉及生物檢測，尤其是指一種基于mil(53)-fe納米酶活性的細菌檢測方法及其應用。
技術介紹
1、近年來，食品安全問題頻發(fā)，據(jù)報道，每年有約三億人患病，約五百萬人死于食源性致病菌感染。食源性致病菌一直是引起食源性疾病的主要原因。大腸桿菌會引起出血性腸炎、溶血性尿毒綜合征等疾病，金黃色葡萄球菌會引起葡萄球菌食物中毒、皮膚和軟組織感染等疾病，嚴重危害人類健康。目前，平板計數(shù)法是最常用的檢測方法，其優(yōu)點是準確性高，但它耗時長且需耗費大量的人力。聚合酶鏈反應(pcr)、基因測序、表面增強拉曼散射(sers)和質譜法等方法雖然分析結果精確，但需要依賴昂貴的試劑和儀器，成本頗高，同時需要具備專業(yè)素質的人員來進行操作。有人預測，到2050年，全球可能會有1000萬人死于耐抗生素細菌感染。目前，中國國標gb?4789.2-2022中規(guī)定的測定金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的方法仍為平板計數(shù)法，該方法所需時間較長、操作繁瑣，在實際場景中有諸多不便。因此，開發(fā)及時有效的方法來辨別食源性病原菌是糧食安全和公共衛(wèi)生的迫切需要。
2、天然酶具有獨特的生物化學性質，能高效催化一系列重要反應。作為催化劑，天然酶具有良好的特異性。基于這些優(yōu)點，天然酶在醫(yī)學、生物技術、食品加工和環(huán)境分析等領域被廣泛研究。然而，生物酶價格昂貴，難以重復使用，且容易受熱變性而失活，因此制備和儲存條件苛刻。納米酶廉價、穩(wěn)定容易合成和功能化，故開發(fā)納米酶取代天然酶在很多領域有廣闊的應用前景。與其他納米酶相比，mof基納米酶具有表面積大、結構穩(wěn)定、傳感能力強等優(yōu)點。作為
3、aunrs是一種貴金屬納米材料，其光學性質獨特，易合成制備，形狀可控，通過其長度和寬度的調節(jié)，可以實現(xiàn)對其吸收波長和顏色的精確控制，建立多色傳感系統(tǒng)。jia-mingliu等人基于fe3+可以對aunrs進行蝕刻的性質，建立了一種檢測i-的高靈敏非聚合比色傳感器。yuan?dan等人利用aunr的獨特特性，基于可控縱橫比的aunrs的化學蝕刻，開發(fā)了用于識別12個核苷酸的比色傳感器陣列。aunrs還具有獨特的物理和化學特性，如表面增強拉曼散射(sers)、表面等離子體共振(spr)、雙光子發(fā)光(tpl)、增強穿透和保持(epr)效應、光熱效應等。據(jù)文獻報道，aunrs的選擇性縮短可以產生一系列獨特的顏色，幾乎覆蓋了400至760納米的整個可見范圍，這些鮮艷的色彩很容易被人類肉眼區(qū)分。此外，馬等人的研究表明，tmb2+可以定量高效地蝕刻aunrs，隨著tmb2+濃度的增加，aunrs的長徑比變小，溶液顏色發(fā)生變化。因此，通過相應的溶液顏色，可以用肉眼輕松區(qū)分tmb2+的確切濃度。
技術實現(xiàn)思路
1、為此，本專利技術所要解決的技術問題在于克服現(xiàn)有技術中缺乏高效且靈敏性高的細菌檢測體系的問題。
2、為解決上述技術問題，本專利技術提供了一種基于mil(53)-fe納米酶活性的細菌檢測方法。本專利技術首先采用溶劑熱法合成了具有過氧化物酶樣活性的鐵基金屬有機骨架(mil(53)-fe)納米顆粒，然后通過π-π鍵吸附將細菌特異性適配體(apt)與mil(53)-fe結合，形成apt-mil(53)-fe細菌探針。由于mil(53)-fe具有過氧化物酶活性，在h2o2存在下能催化3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(tmb)氧化為藍色tmb+。當目標細菌存在時，apt-mil(53)-fe細菌探針與目標細菌特異性結合，使得mil(53)-fe的過氧化物酶活性降低從而減少tmb+的產生。用少量h2so4酸化tmb+溶液后，tmb+轉變?yōu)槟軌蛭g刻aunrs的黃色tmb2+溶液，蝕刻后，aunrs的長度減少。在相同時間內，隨著tmb+的減少，tmb2+濃度隨之減少，蝕刻效果減弱，從而導致aunrs顏色變化緩慢，進而導致aunrs紫外峰值的縱向位移減小。基于這一原理可以建立細菌濃度與aunrs紫外峰值位移之間的相關性曲線，從而實現(xiàn)對細菌的濃度檢測。
3、本專利技術的第一個目的是提供了一種細菌檢測方法，包括以下步驟：
4、s1、將鐵基金屬有機骨架與適配體連接形成細菌探針；
5、s2、將不同濃度的細菌樣品與所述細菌探針共孵育，向孵育液中加入底物進行催化反應，將催化反應后的溶液酸化并加入金納米棒蝕刻，檢測金納米棒的紫外峰值；
6、s3、建立金納米棒的紫外峰值位移與細菌濃度的標準曲線；
7、s4、將待測樣品按照s2操作，檢測金納米棒的紫外峰值位移，根據(jù)s3中的標準曲線，計算得到待測樣品中細菌的濃度；
8、其中，所述適配體識別所述細菌。
9、進一步地，鐵基金屬有機骨架與適配體通過π-π鍵共價連接。
10、進一步地，步驟s1中所述鐵基金屬有機骨架的濃度為(2-4)mg/ml。
11、進一步地，步驟s2中所述底物包含過氧化氫和3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(tmb)。mil(53)-fe具有過氧化物酶活性，在h2o2存在下能催化tmb氧化為藍色tmb+。
12、進一步地，步驟s2中所述催化體系的酸化通過向催化體系中加入酸實現(xiàn)。具有過氧化物酶活性的mil(53)-fe在在h2o2存在下能催化tmb氧化為藍色tmb+，而向催化體系中加入酸能夠使得藍色的tmb+酸化為黃色且具有蝕刻能力的tmb2+，進而蝕刻金納米棒。
13、進一步地，金納米棒的長與直徑的比值為(3-5)：1。
14、進一步地，所述酸包括鹽酸或硫酸。優(yōu)選為硫酸，其中，硫酸的濃度為2m，體積為20-50ul。酸的濃度過低時會導致酸化不完全，酸的濃度過高時會導致tmb+容易變黑，不利于顏色檢測。
15、進一步地，步驟s2中所述共孵育的時間不小于12分鐘。
16、進一步地，步驟s2中所述共孵育的溫度為20-40℃，溫度過高時會導致h2o2分解，進而影響檢測結果。
17、進一步地，步驟s2中所述蝕刻的時間不小于30分鐘。
18、本專利技術的第二個目的是提供了一種上述細菌檢測方法在檢測金黃色葡萄球菌中的應用，所述適配體的基因序列如seq?id?no.1所示。
19、本專利技術的第三個目的是提供了一種上述細菌檢測方法在檢測大腸桿菌中的應用，所述適配體的基因序列如seq?id?no.2所示。
20、本專利技術的有益效果：
21、(1)本專利技術選用適配體作為特異性識別分子，利用π-π鍵吸附的方法使細菌適配體與mil(53)-fe大量共軛，得到了對目標菌具有高靈敏性的細菌探針。本專利技術的細菌探針相較于傳統(tǒng)免疫檢測中的抗體，具有成本低、性能穩(wěn)定和易于標記的優(yōu)點，且具有高度的親和力和高度的特異性；
22、(2)本專利技術利用溶劑熱法合成mil(53)-fe，合成的mil(53)-fe具有優(yōu)異的過氧化物酶活性，同時其合成過程簡單方便、成本較低，同時本專利技術利用a本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種細菌檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權利要求1所述的細菌檢測方法，其特征在于，步驟S1中所述鐵基金屬有機骨架的濃度為(2-4)mg/mL。
3.根據(jù)權利要求1所述的細菌檢測方法，其特征在于，步驟S2中所述底物包含過氧化氫和3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺。
4.根據(jù)權利要求1所述的細菌檢測方法，其特征在于，步驟S2中所述金納米棒的長與直徑的比值為(3-5)：1。
5.根據(jù)權利要求1所述的細菌檢測方法，其特征在于，步驟S2中對所述催化反應后的溶液酸化通過向催化反應后的溶液中加入酸實現(xiàn)，所述酸包括鹽酸或硫酸；其中，所述酸添加的濃度為1-3M，添加的體積為20-50uL。
6.根據(jù)權利要求1所述的細菌檢測方法，其特征在于，步驟S2中所述共孵育的時間不小于12分鐘。
7.根據(jù)權利要求1所述的細菌檢測方法，其特征在于，步驟S2中所述共孵育的溫度為20-40℃。
8.根據(jù)權利要求1所述的細菌檢測方法，其特征在于，步驟S2中所述蝕刻的時間不小于30分鐘。
9.權利要求1-8任一
10.權利要求1-8任一項所述的細菌檢測方法在檢測大腸桿菌中的應用，其特征在于，所述適配體的基因序列如SEQ?ID?NO.2所示。
...【技術特征摘要】
1.一種細菌檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權利要求1所述的細菌檢測方法，其特征在于，步驟s1中所述鐵基金屬有機骨架的濃度為(2-4)mg/ml。
3.根據(jù)權利要求1所述的細菌檢測方法，其特征在于，步驟s2中所述底物包含過氧化氫和3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺。
4.根據(jù)權利要求1所述的細菌檢測方法，其特征在于，步驟s2中所述金納米棒的長與直徑的比值為(3-5)：1。
5.根據(jù)權利要求1所述的細菌檢測方法，其特征在于，步驟s2中對所述催化反應后的溶液酸化通過向催化反應后的溶液中加入酸實現(xiàn)，所述酸包括鹽酸或硫酸；其中，所述酸添加的濃度為1-3m，添加的體積為...
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：王周平，徐纖云，黃耿立，
申請(專利權)人：江南大學，
類型：發(fā)明
國別省市：
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