【技術實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術屬于基因工程，涉及一種用于重組酶介導等溫擴增檢測技術的分子信標探針、其引物組合、raa方法及應用。
技術介紹
1、重組酶介導等溫擴增檢測(recombinase-aidedamplification，raa)技術，是一種2012年我國自主開發(fā)的新型等溫擴增技術。該技術通過利用重組酶，單鏈結合蛋白和dna聚合酶，可以在恒溫條件下實現(xiàn)核酸的快速擴增，適用于目的基因的快速診斷，在核酸檢測領域具有良好的推廣應用前景。
2、在常規(guī)raa技術中，需要至少一對引物和一條探針，以實現(xiàn)目的基因的擴增，對于引物和探針的設計是限制raa技術應用效果的主要因素。其中，探針是raa反應特異性的關鍵因素，不適配的探針會產生非特異性的熒光，造成假陽性或者漏檢。而引物對的設計則是決定raa反應靈敏度的關鍵因素，不合適的引物對會嚴重影響反應的靈敏度，甚至導致陽性樣本的漏檢。因此，對探針或引物對進行針對性設計是提高raa技術特異性和靈敏度的重要研究方向。
3、如公開號為cn118995977a的中國專利技術專利申請公開了一種檢測豬肺炎支原體的raa引物對和探針，對探針進行c3-spacer阻斷修飾，以提高raa反應檢測豬肺炎支原體的特異性和靈敏度。然而，一方面，這種raa技術仍需要一對引物和一條探針共三條核酸序列，給核酸序列合成和實驗操作、試劑存儲均增加負擔，降低檢測效率；另一方面，對探針的設計方案僅用于豬肺炎支原體的檢測，無法確認對其他病原體相關基因的效果，尤其對于需要同時檢出多個基因或者對于耐藥基因有同時檢出需求時，該技術無法
4、耐藥基因與病原體相關基因的同時檢出，是畜牧業(yè)和食品安全領域有待解決的重要問題。例如，金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus，s.aureus)是奶牛乳房炎主要致病菌，奶牛養(yǎng)殖中通常采用卡那霉素、慶大霉素等多種氨基糖苷類抗生素(aas)協(xié)同治療奶牛的乳房炎等疾病。若抗生素通過食物鏈進入人體，并在體內積累，對人體健康造成嚴重危害。不同奶牛場，由于用藥情況不同，其分離的金黃色葡萄球菌的耐藥狀況會有所不同，因此，建立奶牛養(yǎng)殖場金黃色葡萄球菌分離株及其耐藥性的快速、準確檢測，對于奶牛乳房炎早期診斷、和用藥方案調整具有重要意義。目前，對于金黃色葡萄球菌及耐藥基因的檢測仍有賴于食品安全國家標準gb4789.10-2016和藥敏試驗。存在檢測周期長達4天，對檢測人員和設備的要求較高，不利于在基層和現(xiàn)場推廣等問題。
技術實現(xiàn)思路
1、本專利技術的一個目的，是提供一種用于重組酶介導等溫擴增檢測技術的分子信標探針、其引物組合及重組酶介導等溫擴增方法，通過改造raa技術的一條引物為在形成莖環(huán)結構后具有單鏈區(qū)的改造分子信標(improvemolecularbeacons，imb)探針，使imb探針兼具引物和探針功能，達到用于raa技術能提高實驗效率，提升擴增特異性和靈敏度的目的；
2、本專利技術的另一個目的，是提供上述imb探針及其引物組合在等溫擴增檢測試劑盒中，尤其是檢測金黃色葡萄球菌的試劑盒中的應用，達到實現(xiàn)耐藥基因與病原體相關基因同時、快速檢出的目的，降低對檢測人員和設備的要求。
3、為實現(xiàn)上述目的，本專利技術所采用的技術方案如下：
4、一種用于重組酶介導等溫擴增檢測技術的分子信標探針，重組酶介導等溫擴增檢測技術的一條引物為不形成莖環(huán)結構的引物，用于重組酶介導等溫擴增檢測技術的分子信標探針作為重組酶介導等溫擴增檢測技術的另一條引物；所述分子信標探針自5’端至3’端方向，依次包含用于形成莖環(huán)結構莖部的n1區(qū)、用于形成莖環(huán)結構環(huán)部的m區(qū)、用于形成莖環(huán)結構莖部的n2區(qū)以及單鏈區(qū)；
5、其中，n1區(qū)和n2區(qū)的堿基互補配對；n1區(qū)的5’端具有熒光基團結合位點、n2區(qū)的3’端具有與熒光基團匹配的淬滅基團的結合位點；
6、用于形成莖環(huán)結構環(huán)部的m區(qū)、用于形成莖環(huán)結構莖部的n2區(qū)以及單鏈區(qū)依次與目的基因一端的堿基互補配對。即m區(qū)、n2區(qū)及單鏈區(qū)在擴增反應時承擔普通引物與目的基因配對的功能。
7、作為本專利技術的一種限定，所述n1區(qū)及單鏈區(qū)均由5～8個與目的基因一端互補的堿基序列組成。
8、作為本專利技術的另一種限定，所述n1區(qū)和n2區(qū)分別含有1-2個鎖核酸修飾位點。
9、本專利技術還提供了一種引物組合，所述引物組合包含序列為seq?id?no:1的引物gyrbf以及序列為seq?id?no:2的分子信標探針gyrbr；
10、所述分子信標探針gyrbr為所述的用于重組酶介導等溫擴增檢測技術的分子信標探針，即，其具有上述結構，具有用于形成莖環(huán)結構莖部的n1區(qū)、用于形成莖環(huán)結構環(huán)部的m區(qū)、用于形成莖環(huán)結構莖部的n2區(qū)以及單鏈區(qū)。
11、作為本專利技術的進一步限定，所述引物組合還包含序列為seq?id?no:3的分子信標探針genf、序列為seq?id?no:4的引物genr、序列為seq?id?no:5的分子信標探針kanf和序列為seq?id?no:6的引物kanr；
12、所述分子信標探針gyrbr、分子信標探針genf和分子信標探針kanf均為所述的用于重組酶介導等溫擴增檢測技術的分子信標探針，且三者中熒光基團的激發(fā)光波長不同。
13、進一步地，熒光基團可選自fam、vic、joe、tet、cy3、cy5、rox、texas?red或lcred460中的一種，所述淬滅基團選自bhq1、bhq2、bhq3、dabcy1或tamra中的一種。
14、作為本專利技術的一種限定，所述分子信標探針gyrbr的熒光基團為fam；所述分子信標探針genf的熒光基團為vic；所述分子信標探針kanf的熒光基團為aby。
15、本專利技術還提供了上述用于重組酶介導等溫擴增檢測技術的分子信標探針在制備重組酶介導等溫擴增檢測試劑盒中的應用。
16、本專利技術也提供了上述引物組合在制備重組酶介導等溫擴增檢測金黃色葡萄球菌的試劑盒中的應用。
17、本專利技術還提供了一種基于用于重組酶介導等溫擴增檢測技術的分子信標探針的試劑盒，所述試劑盒包含上述引物組合、適宜于重組酶介導等溫擴增反應的試劑體系，以及單鏈dna結合蛋白、重組酶和聚合酶。
18、本專利技術還提供了一種熒光定量重組酶介導等溫擴增方法，采用上述所述的引物組合進行熒光定量重組酶介導等溫擴增反應，反應體系中，所述引物組合的總體積分數(shù)為10～15％，濃度為40μm。其中，上游引物(或用于重組酶介導等溫擴增檢測技術的分子信標探針)和下游引物(或用于重組酶介導等溫擴增檢測技術的分子信標探針)的體積相同。
19、更進一步地，raa反應的反應體系為25μl，反應體系包含引物(即引物gyrbf、分子信標探針gyrbr、分子信標探針genf、引物genr、分子信標探針kanf和引物kanr)、buffer、abuffer、bbuffer、重組酶、重組酶輔助蛋白、單鏈結合蛋白、聚合酶、dntps、模板dna和本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種用于重組酶介導等溫擴增檢測技術的分子信標探針，重組酶介導等溫擴增檢測技術的一條引物為不形成莖環(huán)結構的引物，其特征在于，用于重組酶介導等溫擴增檢測技術的分子信標探針作為重組酶介導等溫擴增檢測技術的另一條引物；
2.根據(jù)權利要求1所述的一種用于重組酶介導等溫擴增檢測技術的分子信標探針，其特征在于，所述N1區(qū)及單鏈區(qū)均由5~8個與目的基因一端互補的堿基序列組成。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的一種用于重組酶介導等溫擴增檢測技術的分子信標探針，其特征在于，所述N1區(qū)和N2區(qū)分別含有1-2個鎖核酸修飾位點。
4.一種引物組合，其特征在于，所述引物組合包含序列為SEQ?ID?NO:1的引物gyrBF以及序列為SEQ?ID?NO:2的分子信標探針gyrBR；
5.根據(jù)權利要求4所述的引物組合，其特征在于，所述引物組合還包含序列為SEQ?IDNO:3的分子信標探針genF、序列為SEQ?ID?NO:4的引物genR、序列為SEQ?ID?NO:5的分子信標探針kanF和序列為SEQ?ID?NO:6的引物kanR；
6.根據(jù)權利要求5
7.權利要求1~3中任意一項所述的用于重組酶介導等溫擴增檢測技術的分子信標探針在制備重組酶介導等溫擴增檢測試劑盒中的應用。
8.權利要求4所述的引物組合在制備重組酶介導等溫擴增檢測金黃色葡萄球菌的試劑盒中的應用。
9.一種基于用于重組酶介導等溫擴增檢測技術的分子信標探針的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含權利要求5所述的引物組合、適宜于重組酶介導等溫擴增反應的試劑體系，以及單鏈DNA結合蛋白、重組酶和聚合酶。
10.一種重組酶介導等溫擴增方法，其特征在于，采用權利要求5或6所述的引物組合進行熒光定量重組酶介導等溫擴增反應，反應體系中，所述引物組合的總體積分數(shù)為10~15%，濃度為40μM。
...【技術特征摘要】
1.一種用于重組酶介導等溫擴增檢測技術的分子信標探針，重組酶介導等溫擴增檢測技術的一條引物為不形成莖環(huán)結構的引物，其特征在于，用于重組酶介導等溫擴增檢測技術的分子信標探針作為重組酶介導等溫擴增檢測技術的另一條引物；
2.根據(jù)權利要求1所述的一種用于重組酶介導等溫擴增檢測技術的分子信標探針，其特征在于，所述n1區(qū)及單鏈區(qū)均由5~8個與目的基因一端互補的堿基序列組成。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的一種用于重組酶介導等溫擴增檢測技術的分子信標探針，其特征在于，所述n1區(qū)和n2區(qū)分別含有1-2個鎖核酸修飾位點。
4.一種引物組合，其特征在于，所述引物組合包含序列為seq?id?no:1的引物gyrbf以及序列為seq?id?no:2的分子信標探針gyrbr；
5.根據(jù)權利要求4所述的引物組合，其特征在于，所述引物組合還包含序列為seq?idno:3的分子信標探針genf、序列為seq?id?no:4的引物genr、序列為seq?id?no:5的分子信...
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：胡連霞，孫睿佳，盧涵，
申請(專利權)人：石家莊學院，
類型：發(fā)明
國別省市：
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