本發明專利技術提供了一種探針和引物組合、標準品、檢測試劑盒、Real?time?PCR檢測方法及其在檢測核酸樣品中的應用。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于分子生物，具體涉及一種用于檢測核酸樣品的探針、探針和引物組合、標準品、real-time?pcr檢測試劑盒和檢測方法。
技術介紹
1、玉米轉化體mn85zn-ex是一種抗蟲耐草銨膦除草劑的玉米轉基因材料（中國專利申請號為（2024119837473），它對草地貪夜蛾和玉米螟等鱗翅目害蟲具有優異的抗性，對草銨膦具有良好的耐受性，利用該轉化體能培育抗蟲抗除草劑玉米品種。建立轉化體特異性檢測方法能為轉基因生物的鑒定和監管提供有效的檢測手段，為農業轉基因生物安全管理提供技術支撐。
2、轉化體特異性的檢測主要利用普通pcr方法，但其缺點是靈敏度不高，且無法實時監控pcr過程，不能定量。隨著分子生物學技術的發展，real-time?pcr（實時熒光定量pcr）已廣泛應用于轉基因檢測，與常規pcr技術相比，其具有耗時短、操作簡便、特異性好、靈敏度高的特點，過程可實時監控，結果可直接觀察，可以進行定量檢測。
3、real-time?pcr方法可分為染料法和探針法兩種。染料法real-time?pcr中的熒光染料能與雙鏈dna結合發出熒光，其結合是非特異性的，體系中的引物二聚體、dna模板等都會與其結合，所以染料法的特異性不高。而探針法中的探針能與模板特異性結合，其擴增曲線反映的就是特異性產物的積累，不會含有非特異擴增的成分，靈敏度比染料法高出10倍。另外，染料法只支持單通道反應，如果需要進行多通道試驗，或是檢測相同樣本的不同靶標，最常用的還是探針法。
技術實現思路
1、為解決上述問題，本專利技術提供了用于檢測核酸樣品的探針、探針和引物組合、標準品、檢測試劑盒、real-time?pcr檢測方法。上述的核酸樣品可以是玉米mn85zn-ex轉化體的基因組dna，也可以是mn85zn-ex轉化體衍生品系的基因組dna，或是含有mn85zn-ex轉化體的混雜玉米材料的基因組dna，或是從上述樣品中通過pcr擴增等方法分離得到的包含mn85zn-ex身份信息的核酸樣品。由于seq?id?no.?1所示序列是確認mn85zn-ex轉化體身份信息的特異性序列，因此只要含有seq?id?no.?1所示序列核酸分子的樣品均可以用本專利技術提供的方法進行檢測。
2、本專利技術通過設計高靈敏度、特異性的探針和引物對，可準確鑒定玉米mn85zn-ex轉化體，能將其與不含mn85zn-ex的常規玉米和其他轉基因玉米材料分開。該檢測方法具有較高的特異性、靈敏性和操作便利性等優點，彌補了常規pcr方法流程繁瑣、檢測靈敏度低的缺點。
3、本專利技術提供了一種探針，其特征在于：所述探針的核苷酸序列為5'-ctcaaaccaccaccggcgtcg-3'。
4、在一些實施方案中，所述探針5’端標記有熒光基團，3’端標記有淬滅基團。當探針處于游離狀態時，熒光基團發出的熒光會被淬滅基團吸收；在pcr擴增過程中，與模板緊密結合的探針5’端熒光基團會被taq酶切開，從而遠離3’端的淬滅基團，熒光基團發出的熒光能被儀器接收，產生的熒光信號與樣本中擴增產物的量成正比。
5、在一些實施方案中，所述熒光基團包括fam、tet、hex、cy3、joe、vic、rox、cy5、tamra或texas中的任一種；所述淬滅基團包括bhq1、bhq2、bhq-x、tamra、dabcyl或mgb中的任一種；
6、在一些實施方案中，所述熒光基團/淬滅基團的組合為fam/bhq1、fam/bhq2、cy3/bhq-x、hex/dabcyl、joe/tamra或vic/bhq2中的任一種；
7、在隨機選取的熒光基團和淬滅基團測試試驗中，上述熒光基團和淬滅基團標記的探針均能夠得到特異性的檢測結果。同時，5’端標記fam、3’端標記bhq1的探針標記成本最低，可以作為最優選的探針標記方案。
8、本專利技術還提供了一種引物和探針組合，其特征在于：包括上述的探針和兩條引物，所述引物的核苷酸序列為5'-tagggtttcgctcatgtgttga-3'和5'-ctgctggaagagaccctgatg-3'；
9、上述的探針以及探針和引物組合是通過軟件設計、試驗篩選驗證挑選出來的，定位于mn85zn-ex轉化體外源插入序列上游邊界處。
10、本專利技術還提供了一種標準品，其特征在于：所述標準品為濃度不低于128拷貝/μl的一個或多個核酸樣品；所述核酸樣品含有seq?id?no.?1所示序列的核酸分子；
11、在一些實施方案中，所述標準品為5個濃度分別為80000拷貝/μl、16000拷貝/μl、3200拷貝/μl、640拷貝/μl和128拷貝/μl的mn85zn-ex基因組dna；所述dna樣品含有seq?idno.?1所示的核酸分子；
12、在一些實施方案中，所述標準品的制備方法為：取濃度為1.0?μg/μl的mn85zn-ex基因組dna樣品，依次稀釋5倍、25倍、125倍、625倍、3125倍。
13、本專利技術還提供了一種檢測試劑盒，其特征在于：所述檢測試劑盒包括上述的探針和引物組合以及上述的標準品；
14、在一些實施方案中，所述檢測試劑盒包括：
15、引物1，序列為5'-tagggtttcgctcatgtgttga-3'；
16、引物2，序列為5'-ctgctggaagagaccctgatg-3'；
17、探針，序列為5'-ctcaaaccaccaccggcgtcg-3'；
18、標準品，為5個濃度分別為80000拷貝/μl、16000拷貝/μl、3200拷貝/μl、640拷貝/μl和128拷貝/μl的mn85zn-ex基因組dna樣品；所述核酸樣品含有seq?id?no.?1所示序列的核酸分子；
19、其中，所述探針5’端標記熒光基團fam，3’端標記淬滅基團bhq1。
20、本專利技術還提供了一種real-time?pcr檢測方法，其特征在于：使用上述的檢測試劑盒進行real-time?pcr檢測，其中pcr反應體系中的引物1和引物2終濃度均為0.4?μm，探針終濃度為0.2?μm。
21、本專利技術還提供了上述的探針、探針和引物組合、標準品、檢測試劑盒、檢測方法在定性或定量檢測核酸樣品中的應用；其中，所述核酸樣品含有seq?id?no.?1所示序列的核酸分子。
22、本專利技術的有益效果是：經過軟件設計以及多次試驗篩選，從大量探針引物組合中獲得了1條探針和2條引物的組合，在此基礎上利用合適濃度梯度的標準品建立并優化了real-time?pcr檢測方法，應用上述探針、探針和引物組合、標準品、檢測試劑盒、real-timepcr檢測方法可以特異性地檢測濃度不低于128拷貝/μl的含有seq?id?no.?1的核酸樣品，并能有效地將mn85zn-ex材料與其他不含mn85zn-ex的玉米材料區分開，具有極高的靈敏度和特異性。
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【技術保護點】
1.探針和引物組合，其特征在于，所述探針的核苷酸序列為5'-CTCAAACCACCACCGGCGTCG-3'，所述引物的核苷酸序列為5'-TAGGGTTTCGCTCATGTGTTGA-3'和5'-CTGCTGGAAGAGACCCTGATG-3'。
2.根據權利要求1所述的探針和引物組合，其特征在于，所述探針5’端標記有熒光基團，3’端標記有淬滅基團；
3.根據權利要求2所述的探針和引物組合，其特征在于，所述熒光基團和淬滅基團的組合為FAM/BHQ1、FAM/BHQ2、CY3/BHQ-X、HEX/DABCYL、JOE/TAMRA或VIC/BHQ2中的任一種。
4.根據權利要求3所述的探針和引物組合，其特征在于，所述熒光基團為FAM；所述淬滅基團為BHQ1。
5.檢測試劑盒，其特征在于：所述檢測試劑盒包括權利要求1-4任一項所述的探針和引物組合以及標準品；
6.根據權利要求5所述的檢測試劑盒，其特征在于：所述標準品為5個濃度分別為80000拷貝/μL、16000拷貝/μL、3200拷貝/μL、640拷貝/μL和128拷貝/μL的MN85zN-Ex基因組DNA。
7.Real-time?PCR檢測方法，其特征在于：使用權利要求5-6任一項所述的檢測試劑盒進行Real-time?PCR檢測，其中PCR反應體系中的引物終濃度均為0.4?μM，探針終濃度為0.2μM。
8.權利要求1-4任一項所述的探針和引物組合、權利要求5-6任一項所述的檢測試劑盒、權利要求7所述的檢測方法在定量檢測MN85zN-Ex樣品中的應用；
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【技術特征摘要】
1.探針和引物組合，其特征在于，所述探針的核苷酸序列為5'-ctcaaaccaccaccggcgtcg-3'，所述引物的核苷酸序列為5'-tagggtttcgctcatgtgttga-3'和5'-ctgctggaagagaccctgatg-3'。
2.根據權利要求1所述的探針和引物組合，其特征在于，所述探針5’端標記有熒光基團，3’端標記有淬滅基團；
3.根據權利要求2所述的探針和引物組合，其特征在于，所述熒光基團和淬滅基團的組合為fam/bhq1、fam/bhq2、cy3/bhq-x、hex/dabcyl、joe/tamra或vic/bhq2中的任一種。
4.根據權利要求3所述的探針和引物組合，其特征在于，所述熒光基團為fam；所述淬滅基團為bhq1。
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【專利技術屬性】
技術研發人員：酈娟，曠樂，劉萍，辛博，李弘婧，
申請(專利權)人：萊肯生物科技海南有限公司，
類型：發明
國別省市：
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