【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及蛋白質(zhì)檢測(cè)，尤其是涉及一種基于陣列式納米孔結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法。
技術(shù)介紹
1、現(xiàn)代蛋白質(zhì)組學(xué)在很大程度上依賴于串聯(lián)質(zhì)譜（ms）技術(shù)，因其高精度和在復(fù)雜混合物中識(shí)別及定量蛋白質(zhì)的能力而受到重視。然而，大多數(shù)質(zhì)譜分析器體積龐大，投資成本高，維護(hù)費(fèi)用昂貴，且需要專業(yè)人員操作。隨著人們對(duì)高通量蛋白質(zhì)組學(xué)研究和個(gè)性化醫(yī)療不斷增長(zhǎng)的需求，亟需開(kāi)發(fā)可擴(kuò)展且低成本的蛋白質(zhì)分析技術(shù)。
2、與質(zhì)譜設(shè)備相比，基于納米孔的檢測(cè)技術(shù)提供了一個(gè)低成本和高通量的平臺(tái)，并且能夠適應(yīng)原生環(huán)境。在納米孔分析中，當(dāng)分析物通過(guò)單個(gè)納米孔時(shí)，在施加電位的作用下，會(huì)阻斷通過(guò)納米孔的離子電流。重要的是，電流阻斷的大小主要與分析物排除的體積成正比，這允許對(duì)化學(xué)性質(zhì)相似的（生物）聚合物如peg鏈、dna、蛋白質(zhì)和肽段進(jìn)行尺寸區(qū)分。此外，納米孔能夠準(zhǔn)確檢測(cè)包括蛋白質(zhì)和dna在內(nèi)的各種分子，并且具備無(wú)標(biāo)記、快速、單分子水平高精度的優(yōu)勢(shì)。
3、目前生物納米孔檢測(cè)技術(shù)已被證實(shí)可以實(shí)現(xiàn)20種氨基酸的高靈敏的檢測(cè)分辨，最近，martin-baniandres等人[1]使用一種工程化的帶電選擇性納米孔，利用電滲現(xiàn)象來(lái)實(shí)現(xiàn)單個(gè)肽鏈的非酶捕獲、展開(kāi)和轉(zhuǎn)運(yùn)，實(shí)現(xiàn)肽鏈內(nèi)部翻譯后修飾的檢測(cè)，這些肽鏈的長(zhǎng)度可以超過(guò)1200個(gè)氨基酸殘基，為納米孔實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)讀長(zhǎng)蛋白質(zhì)測(cè)序提供一個(gè)可能。?nova等人[2]利用hel308?解旋酶控制肽鏈通過(guò)納米孔的傳感區(qū)域，實(shí)現(xiàn)了對(duì)單個(gè)分子水平上的磷酸化修飾的檢測(cè)，并能以95%的準(zhǔn)確率區(qū)分具有一個(gè)或兩個(gè)緊密磷酸化位點(diǎn)的肽序列，但由于納米孔
4、因此，提出一種基于陣列式組合納米孔結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)測(cè)序方法。首先，在一塊芯片膜上加工陣列凹槽，并在每個(gè)凹槽底部位置都固定一個(gè)對(duì)dna鏈具有合成或者解旋功能的蛋白；繼而在凹槽頂部鋪上一層磷脂雙分子層，將對(duì)蛋白質(zhì)和dna分子具有高分辨率讀取能力的蛋白嵌入凹槽上層的磷脂雙分子層中；當(dāng)肽鏈修飾的dna分子通過(guò)嵌入磷脂雙分子層中的讀取蛋白進(jìn)入凹槽中并與凹槽底部的功能蛋白結(jié)合時(shí)，固定在凹槽底部的功能蛋白開(kāi)始對(duì)dna分子進(jìn)行合成或者解旋，驅(qū)動(dòng)dna分子上經(jīng)肽鏈修飾部分通過(guò)嵌入磷脂雙分子層中的讀取蛋白，產(chǎn)生不同的阻塞電流幅值，完成對(duì)修飾在dna分子上的肽鏈讀取。兩種功能蛋白之間的相對(duì)距離是影響修飾在dna分子上肽鏈讀長(zhǎng)的關(guān)鍵因素，本方法中兩種功能蛋白之間的相對(duì)距離可以通過(guò)對(duì)芯片膜厚和凹槽的加工深度進(jìn)行控制，有效解決了肽鏈因納米空間限制而導(dǎo)致的讀長(zhǎng)短的難題。同時(shí)，這種陣列式的組合蛋白傳感器還可以實(shí)現(xiàn)對(duì)肽鏈的高通量檢測(cè)。
5、[1]martin-baniandres,?p.,?lan,?wh.,?board,?s.?et?al.?enzyme-lessnanopore?detection?of?post-translational?modifications?within?longpolypeptides.?nat.?nanotechnol.?18,?1335–1340?(2023).
6、[2]nova,?i.c.,?ritmejeris,?j.,?brinkerhoff,?h.?et?al.?detection?ofphosphorylation?post-translational?modifications?along?single?peptides?withnanopores.?nat?biotechnol?42,?710–714?(2024).
7、[3]motone,?k.,?kontogiorgos-heintz,?d.,?wee,?j.?et?al.?multi-pass,single-molecule?nanopore?reading?of?long?protein?strands.?nature?633,?662–669(2024).
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)的目的是提供一種基于陣列式納米孔結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法，納米孔結(jié)構(gòu)中兩種功能蛋白之間的相對(duì)距離可以通過(guò)對(duì)芯片膜厚和凹槽的加工深度進(jìn)行調(diào)節(jié)，有效解決了肽鏈因納米空間限制而導(dǎo)致的讀長(zhǎng)短的難題；同時(shí)陣列式的組合蛋白傳感器還可以實(shí)現(xiàn)對(duì)肽鏈的高通量檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的、長(zhǎng)讀長(zhǎng)、高準(zhǔn)確的蛋白測(cè)序。
2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)提供了一種基于陣列式納米孔結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法，包括以下步驟：
3、1）構(gòu)建陣列式納米孔結(jié)構(gòu)：
4、步驟1，芯片薄膜進(jìn)行陣列凹槽加工：在芯片薄膜上加工有一定間距和深度的陣列凹槽；
5、步驟2，芯片薄膜底部連接溫度控制元件：將溫度控制元件與芯片薄膜底部進(jìn)行連接；
6、步驟3，將蛋白固定在陣列凹槽底部：將對(duì)dna鏈具有合成及解旋功能的蛋白固定在每個(gè)陣列凹槽的底部；
7、步驟4，芯片薄膜表面覆蓋磷脂層：將磷脂雙分子層涂抹在芯片薄膜表面，在陣列凹槽的表面形成一層磷脂雙分子層；
8、步驟5，電驅(qū)動(dòng)嵌入功能蛋白：將對(duì)蛋白質(zhì)和dna分子具有高分辨率讀取能力的蛋白嵌入陣列凹槽表面的磷脂雙分子層，得到陣列式納米孔結(jié)構(gòu)；
9、2）進(jìn)行蛋白質(zhì)檢測(cè)：
10、步驟6，經(jīng)肽鏈修飾的dna在電場(chǎng)力驅(qū)動(dòng)下通過(guò)鑲嵌在磷脂雙分子層上的功能蛋白，產(chǎn)生阻塞電流信號(hào)；此時(shí)啟動(dòng)溫度控制元件，使其對(duì)電解質(zhì)溶液進(jìn)行升溫，直至達(dá)到陣列凹槽底部蛋白的正常工作溫度；當(dāng)經(jīng)肽鏈修飾的dna運(yùn)動(dòng)到與陣列凹槽底部的蛋白結(jié)合時(shí)，陣列凹槽底部蛋白以單鏈dna分子為模板，合成或解開(kāi)雙鏈dna的過(guò)程中，驅(qū)動(dòng)修飾在dna鏈上的肽鏈通過(guò)具有高分辨率讀取能力的蛋白，實(shí)現(xiàn)對(duì)肽鏈的信息讀取。
11、進(jìn)一步地，步驟1中陣列凹槽為矩形陣列或環(huán)形陣列，陣列的間距為100nm-100μm，陣列凹槽的深度為100nm-1mm。
12、進(jìn)一步地，步驟2中溫度控制元件包括帕爾貼元件。
13、進(jìn)一步地，步驟3中對(duì)dna鏈具有合成及解旋功能的蛋白包括dna合成酶，dna解旋酶、dna拓?fù)洚悩?gòu)酶等。
14、進(jìn)一步地，步驟5中對(duì)蛋白質(zhì)和dna分子具有高分辨率讀取能力的蛋白包括mspa、sp1、α-hl、aerolysin、phi29、csgg、spp1、frac。
15、本專利技術(shù)的檢測(cè)原理為：
16、經(jīng)肽鏈修飾的dna在電場(chǎng)力驅(qū)動(dòng)下通過(guò)鑲嵌在磷脂雙分子層上的功能蛋白，產(chǎn)生阻塞電流信號(hào)；此時(shí)啟動(dòng)溫度控制元件，使其對(duì)電解質(zhì)溶液進(jìn)行升溫，直至達(dá)到陣列凹槽底部蛋白的正常工作溫度；當(dāng)經(jīng)肽鏈修飾的dna運(yùn)本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種基于陣列式納米孔結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于陣列式納米孔結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法，其特征在于：步驟1中陣列凹槽為矩形陣列或環(huán)形陣列、陣列的間距為100nm-100μm，陣列凹槽的深度為100nm-1mm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于陣列式納米孔結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法，其特征在于：步驟2中溫度控制元件包括帕爾貼元件。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于陣列式納米孔結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法，其特征在于：步驟3中對(duì)DNA鏈具有合成及解旋功能的蛋白包括DNA合成酶、DNA解旋酶或DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于陣列式納米孔結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法，其特征在于：步驟5中對(duì)蛋白質(zhì)和DNA分子具有高分辨率讀取能力的蛋白包括MspA、SP1、α-HL、aerolysin、Phi29、CsgG、SPP1或FraC。
【技術(shù)特征摘要】
1.一種基于陣列式納米孔結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于陣列式納米孔結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法，其特征在于：步驟1中陣列凹槽為矩形陣列或環(huán)形陣列、陣列的間距為100nm-100μm，陣列凹槽的深度為100nm-1mm。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于陣列式納米孔結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法，其特征在于：步驟2中溫度控制元件包括帕爾貼元件。
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：吳宏文，袁志山，許德榮，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：江西省轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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