本發明專利技術提供了一種微生物擴增子二代建庫的方法及裝置。其中，方法包括：利用特定識別微生物的引物對樣本DNA、陰性樣本和陽性樣本進行PCR擴增，分別得到第一擴增產物、第二擴增產物和第三擴增產物；利用第一擴增產物、第二擴增產物和第三擴增產物進行文庫構建，分別得到第一文庫、第二文庫和第三文庫；將第一文庫、第二文庫和第三文庫進行測序，并利用第二文庫和第三文庫的測序數據判斷第一文庫的構建質量，以獲得質量合格的微生物擴增子文庫。在微生物擴增子文庫構建過程中引入陰性樣本及陽性樣本，利用陰性樣本及陽性樣本的測序結果，判斷待測樣本的文庫構建質量是否合格，能夠較為簡便的得到待測樣本測序數據的準確性。
【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及文庫構建，具體而言，涉及一種微生物擴增子二代建庫的方法及裝置。
技術介紹
1、針對微生物擴增子擴增和建庫測序流程有2種不同的技術方案。第一種是針對微生物(細菌和真菌)的核糖體亞基(細菌主要是16s、5s、23s；真菌主要是18s、28s、5s、5.8s)設計保守區域通用性簡并堿基引物(引物上帶有6-8堿基barcord標記)，對目標區域進行擴增(細菌16sv34、v4、v45、v57、16s全長；真菌its1、its2等)，然后對擴增的產物進行末端修復、加接頭(帶有8-12堿基index序列)進行建庫處理，然后對文庫進行測序；另外一種技術路線是對上述目標區域設計全長的擴增序列(包含index和barcord序列)，擴增目的片段完成后，再用通用性引物進行二次擴增。
2、但當前兩種技術路線都不包含擴增的目的片段的準確性監控，對于擴增、建庫、上機測序一系列流程機最終的數據產出沒有進行監控的依據。因而，無法確定所構建的文庫質量是否符合理論研究分析的實際需要，無法排除擴增產物中是否含有實驗過程中引入的空氣污染、人為污染或試劑耗材本身帶有細菌和真菌造成的污染等種可能種影響文庫質量的污染。因此，在微生物擴增子二代建庫測序過程中引入對建庫產物進行監控的標準流程，對進一步確保微生物擴增子二代建庫具有較高的質量十分重要。
技術實現思路
1、本專利技術的主要目的在于提供一種微生物擴增子二代建庫的方法及裝置，以解決現有技術中微生物擴增子二代建庫過程中缺少質量監控的問題。
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p>2、為了實現上述目的，根據本專利技術的第一個方面，提供了一種微生物擴增子二代建庫的方法，包括：利用特定識別微生物的引物對樣本dna、陰性樣本和陽性樣本進行pcr擴增，分別得到第一擴增產物、第二擴增產物和第三擴增產物；利用第一擴增產物、第二擴增產物和第三擴增產物進行文庫構建，分別得到第一文庫、第二文庫和第三文庫；將第一文庫、第二文庫和第三文庫進行測序，并利用第二文庫和第三文庫的測序數據判斷第一文庫的構建質量，以獲得質量合格的微生物擴增子文庫；其中，陰性樣本為tris-hcl緩沖液；陽性樣本包括listeria?monocytogenes、pseudomonas?aeruginosa、bacillus?subtilis、saccharomyces?cerevisiae、escherichia?coli、salmonella?enterica、lactobacillusfermentum、enterococcus?faecalis、cryptococcus?neoformans或staphylococcusaureus中的一種或多種。3、進一步地，利用第二文庫和第三文庫的測序數據進行第一文庫的構建質量的判斷包括：利用下式ⅰ計算得到陽性比率；其中，asv為擴增子序列變體，當第三文庫的raw?reads≥5萬條且陽性比率≥95％，且第二文庫的raw?reads≤1000條時，第一文庫的構建質量合格。
4、進一步地，利用phusion超保真dna聚合酶進行pcr擴增。
5、進一步地，特定識別微生物的引物如seq?id?nos:1-14所示。
6、為了實現上述目的，根據本專利技術的第二個方面，提供了一種微生物擴增子二代建庫的裝置，包括：pcr擴增模塊，被設置為利用特定識別微生物的引物對樣本dna、陰性樣本和陽性樣本進行pcr擴增，分別得到第一擴增產物、第二擴增產物和第三擴增產物；文庫構建模塊，被設置為利用第一擴增產物、第二擴增產物和第三擴增產物進行文庫構建，分別得到第一文庫、第二文庫和第三文庫；測序及質量評估模塊，被設置為將第一文庫、第二文庫和第三文庫進行測序，并利用第二文庫和第三文庫的測序數據判斷第一文庫的構建質量，以獲得質量合格的微生物擴增子文庫；其中，陰性樣本為tris-hcl緩沖液；陽性樣本包括listeria?monocytogenes、pseudomonas?aeruginosa、bacillus?subtilis、saccharomycescerevisiae、escherichia?coli、salmonella?enterica、lactobacillus?fermentum、enterococcus?faecalis、cryptococcus?neoformans或staphylococcus?aureus中的一種或多種。
7、進一步地，測序及質量評估模塊包括：計算單元，被設置為利用下式ⅰ計算得到陽性比率；其中，asv為擴增子序列變體；判斷單元，當第三文庫的raw?reads≥5萬條且陽性比率≥95％，且第二文庫的rawreads≤1000條時，第一文庫的構建質量合格。
8、進一步地，利用phusion超保真dna聚合酶進行pcr擴增。
9、進一步地，特定識別微生物的引物如seq?id?nos:1-14所示。
10、為了實現上述目的，根據本專利技術的第三個方面，提供了一種計算機可讀儲存介質，儲存介質包括存儲的程序，其中，在程序運行時，控制儲存介質所在設備執行上述的方法。
11、為了實現上述目的，根據本專利技術的第四個方面，提供了一種處理器，處理器用于運行程序，其中，程序運行上述的方法。
12、應用本專利技術的技術方案，在微生物擴增子文庫構建過程中引入陰性樣本及陽性樣本，利用陰性樣本及陽性樣本的測序結果，判斷待測樣本的文庫構建質量是否合格，能夠較為簡便的得到待測樣本測序數據的準確性，排除實驗過程中使用的試劑耗材、人為操作、樣本間交叉污染等環節存在污染對測序數據的影響，為利用待測樣本的文庫測序數據進行進一步的生物學和/或臨床研究分析的準確性提供了保障。
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【技術保護點】
1.一種微生物擴增子二代建庫的方法，其特征在于，包括：
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，利用所述第二文庫和所述第三文庫的測序數據進行所述第一文庫的構建質量的判斷包括：
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，利用Phusion超保真DNA聚合酶進行所述PCR擴增。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述特定識別微生物的引物如SEQ?IDNOs:1-14所示。
5.一種微生物擴增子二代建庫的裝置，其特征在于，包括：
6.根據權利要求5所述的裝置，其特征在于，所述測序模塊包括：
7.根據權利要求5所述的裝置，其特征在于，利用Phusion超保真DNA聚合酶進行所述PCR擴增。
8.根據權利要求5所述的裝置，其特征在于，所述特定識別微生物的引物如SEQ?IDNOs:1-14所示。
9.一種計算機可讀儲存介質，其特征在于，所述儲存介質包括存儲的程序，其中，在所述程序運行時，控制所述儲存介質所在設備執行權利要求1至4中任一項所述的方法。
10.一種處理器，其特征在于，所述處理器用于運行程序，其中，所述程序運行權利要求1至4中任一項所述的方法。
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【技術特征摘要】
1.一種微生物擴增子二代建庫的方法，其特征在于，包括：
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，利用所述第二文庫和所述第三文庫的測序數據進行所述第一文庫的構建質量的判斷包括：
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，利用phusion超保真dna聚合酶進行所述pcr擴增。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述特定識別微生物的引物如seq?idnos:1-14所示。
5.一種微生物擴增子二代建庫的裝置，其特征在于，包括：
6.根據權利要求5所述的裝置，其特征在于...
【專利技術屬性】
技術研發人員：郭松，湯曉燕，王樹昆，張雪，張昊，
申請(專利權)人：天津諾禾醫學檢驗所有限公司，
類型：發明
國別省市：
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