【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專(zhuān)利技術(shù)涉及醫(yī)學(xué)生物材料，尤其涉及一種脫細(xì)胞基質(zhì)及其制備方法。
技術(shù)介紹
1、脫細(xì)胞基質(zhì)材料是指在細(xì)胞外基質(zhì)成分與結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，通過(guò)脫細(xì)胞工藝去除細(xì)胞而保留其生物活性成分的基質(zhì)材料，是由多種信號(hào)分子構(gòu)成高度協(xié)調(diào)的有機(jī)統(tǒng)一體，能夠誘導(dǎo)并促進(jìn)細(xì)胞的黏附、增殖、分化及組織形成，是機(jī)體組織修復(fù)的基礎(chǔ)，該材料是最為接近機(jī)體組織生理性結(jié)構(gòu)和功能的生物型創(chuàng)傷修復(fù)產(chǎn)品。但由于制備過(guò)程中對(duì)結(jié)構(gòu)的破壞以及部分材料本身的結(jié)構(gòu)特性，脫細(xì)胞基質(zhì)材料力學(xué)性能整體偏低，限制了其在運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的應(yīng)用。
2、水生動(dòng)物源脫細(xì)胞基質(zhì)因其具有良好的生物相容性和無(wú)人畜共患病毒傳播風(fēng)險(xiǎn)，近年來(lái)受到越來(lái)越多的關(guān)注。水生動(dòng)物由于生長(zhǎng)環(huán)境的影響，其細(xì)胞外基質(zhì)的理化性質(zhì)呈現(xiàn)出顯著的多樣性，部分動(dòng)物組織在結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和力學(xué)性能上明顯優(yōu)于陸生動(dòng)物。專(zhuān)利cn116236622a公開(kāi)了一種功能活性梯度仿生生物肩袖補(bǔ)片及其制備方法，該制備方法以水產(chǎn)來(lái)源的脫細(xì)胞基質(zhì)材料作為基材，在常溫真空壓制條件下促進(jìn)膠黏劑成份充分浸潤(rùn)到基材中，該法采用的真空壓制方法會(huì)對(duì)孔隙結(jié)構(gòu)有明顯破壞，不利于細(xì)胞增殖；且該方法是經(jīng)過(guò)物理粘合作用輔助增強(qiáng)力學(xué)性能，材料較厚，臨床舒適性差，且粘合存在一定脫落的風(fēng)險(xiǎn)。專(zhuān)利cn113476667a公開(kāi)了一種魚(yú)皮脫細(xì)胞真皮基質(zhì)支架及其制備方法，該制備方法未對(duì)材料結(jié)構(gòu)進(jìn)行有效保護(hù)，制備的支架材料的力學(xué)性能仍有較大提升空間；且該方法制備的交聯(lián)脫細(xì)胞基質(zhì)材料存在一定的細(xì)胞毒性，細(xì)胞增殖率較低。專(zhuān)利cn111359016a公開(kāi)了一種低抗原性魚(yú)皮組織及其處理方法，該方法交聯(lián)后
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、首先，為了解決現(xiàn)有技術(shù)制備的脫細(xì)胞基質(zhì)材料力學(xué)性能不足、細(xì)胞增殖率較低且舒適性較差的問(wèn)題，本專(zhuān)利技術(shù)提供了一種脫細(xì)胞基質(zhì)，其制備方法包括：脫細(xì)胞、穩(wěn)定化、交聯(lián)和清洗步驟；所述交聯(lián)包括循環(huán)在交聯(lián)劑溶液中靜置交聯(lián)和在平衡緩沖液體系中超聲平衡，每完成一次交聯(lián)及超聲平衡為一個(gè)循環(huán)過(guò)程；每循環(huán)一次后提高交聯(lián)劑濃度進(jìn)行下一次交聯(lián)。
2、本專(zhuān)利技術(shù)發(fā)現(xiàn)，通過(guò)在逐漸升高濃度的交聯(lián)劑中進(jìn)行梯度交聯(lián)，這樣能夠有效提高微纖維蛋白之間的鍵合，同時(shí)避免交聯(lián)劑濃度過(guò)高導(dǎo)致材料表面過(guò)度交聯(lián)，以致基質(zhì)組織微孔變小、阻礙交聯(lián)液繼續(xù)滲透到材料內(nèi)部，最終影響材料整體交聯(lián)度和交聯(lián)均勻性，從而實(shí)現(xiàn)材料力學(xué)性能和抗消化性補(bǔ)強(qiáng)，所制得的脫細(xì)胞基質(zhì)材料薄而韌，拉伸強(qiáng)度和孔隙率均非常高，可有效解決現(xiàn)有技術(shù)中脫細(xì)胞基質(zhì)材料力學(xué)性能不足和舒適性較差的問(wèn)題，同時(shí)本專(zhuān)利技術(shù)脫細(xì)胞基質(zhì)的細(xì)胞增殖率也較高。
3、優(yōu)選地，脫細(xì)胞基質(zhì)的制備方法采用的原料為水生動(dòng)物源材料，優(yōu)選為水生動(dòng)物組織，較優(yōu)選為魚(yú)類(lèi)的結(jié)締組織、軟體動(dòng)物的軟骨組織或骨組織，更優(yōu)選為魚(yú)類(lèi)的皮膚或軟體動(dòng)物的軟骨組織。
4、優(yōu)選地，水生動(dòng)物源材料的密度為0.05～0.80?g/cm3，優(yōu)選0.10～0.70?g/cm3，更優(yōu)選0.20～0.60?g/cm3。
5、當(dāng)選擇上述組織纖維密度較高的水生動(dòng)物源材料時(shí)，配合梯度交聯(lián)反應(yīng)能夠獲得更好的力學(xué)性能和舒適性。
6、在一些實(shí)施方案中，初始交聯(lián)劑溶液的濃度為0.05%~0.25%，每循環(huán)一次后提高1%~5%的交聯(lián)劑濃度；優(yōu)選提高1.5%~4%的交聯(lián)劑濃度。
7、在一些實(shí)施方案中，循環(huán)次數(shù)為2次以上；優(yōu)選為3次以上。
8、在具體實(shí)施過(guò)程中，可根據(jù)不同的脫細(xì)胞基質(zhì)材料需求，選擇合適的交聯(lián)劑濃度梯度以及循環(huán)次數(shù)。
9、在具體實(shí)施過(guò)程中，所述交聯(lián)在室溫下進(jìn)行（優(yōu)選20~25℃）。
10、在一些實(shí)施方案中，所述交聯(lián)包括先在平衡緩沖液體系中超聲后，循環(huán)在交聯(lián)劑溶液中靜置交聯(lián)和在平衡緩沖液體系中超聲平衡；第一次循環(huán)中交聯(lián)劑溶液的濃度為0.05%~0.25%，第二次循環(huán)中交聯(lián)劑溶液的濃度為2%~3%，第三次循環(huán)中交聯(lián)劑溶液的濃度為5%~6%。
11、在一些實(shí)施方案中，隨著交聯(lián)劑溶液的濃度提高，在交聯(lián)劑溶液中靜置交聯(lián)的時(shí)間逐漸減少。
12、在一些實(shí)施方案中，第一次循環(huán)中靜置交聯(lián)的時(shí)間為15~18h，第二次循環(huán)中靜置交聯(lián)的時(shí)間為1~3h，第三次循環(huán)中靜置交聯(lián)的時(shí)間為0.5~1.5h。
13、在一些實(shí)施方案中，每次循環(huán)中在平衡緩沖液中超聲的時(shí)間為1~3h。
14、在一些實(shí)施方案中，所述交聯(lián)劑為環(huán)氧化合物、醛類(lèi)、有機(jī)過(guò)氧化物、碳二亞胺中的至少一種；優(yōu)選地，所述交聯(lián)劑包括甘油二縮水甘油基醚、戊二醛、乙酸酐中的至少一種。
15、在一些實(shí)施方案中，所述平衡緩沖液包括磷酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷緩沖液、巴比妥緩沖液、硼酸鹽緩沖液、碳酸氫鹽緩沖體系、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液中的至少一種；優(yōu)選磷酸鹽緩沖液、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液。
16、在一些實(shí)施方案中，所述平衡緩沖液的ph為7.5～10.5（優(yōu)選ph為7.0～9.0），所述平衡緩沖液的濃度為0.01~1?mol/l（優(yōu)選為0.05～0.5?mol/l，更優(yōu)選為0.05~0.2?mol/l）。
17、在一些實(shí)施方案中，所述超聲的功率為60～120?w，優(yōu)選80～100?w。
18、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述清洗包括在逐漸降低濃度的鹽溶液中進(jìn)行梯度清洗。
19、為了進(jìn)一步解決現(xiàn)有技術(shù)制備的脫細(xì)胞基質(zhì)存在的制劑殘留不易脫除、免疫風(fēng)險(xiǎn)和生物安全風(fēng)險(xiǎn)高的難題，本專(zhuān)利技術(shù)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)通過(guò)梯度鹽溶液清洗的方式，能夠利用濃度差的分子擴(kuò)散作用置換已交聯(lián)基質(zhì)內(nèi)的殘留試劑，實(shí)現(xiàn)殘留試劑的有效去除，降低免疫風(fēng)險(xiǎn)和生物安全風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)還能夠防止脫細(xì)胞基質(zhì)在傳統(tǒng)清洗過(guò)程中導(dǎo)致的力學(xué)性能下降的問(wèn)題。
20、在一些實(shí)施方案中，所述清洗的方式包括但不限于高速攪拌回流法、噴氣回流超聲法、超聲振蕩法、噴氣超聲法中的至少一種。
21、優(yōu)選地，所述高速攪拌的轉(zhuǎn)速為200～2000?rpm，優(yōu)選600～1600?rpm，進(jìn)一步優(yōu)選800～1200?rpm。
22、優(yōu)選地，清洗次數(shù)為2次以上；更優(yōu)選為3次以上。
23、優(yōu)選地，初始清洗的鹽溶液濃度為0.5~1.5?mol/l，每次清洗后降低0.2~0.6?mol/l的鹽溶液濃度；優(yōu)選降低0.2~0.5?mol/l的鹽溶液濃度。
24、優(yōu)選地，最后一次清洗在純水中清洗（優(yōu)選清洗1~10h或2~8h）。
25、優(yōu)選地，第一次清洗中的鹽溶液濃度為0.8~1mol/l，第二次清洗中的鹽溶液濃度為0.5~0.6?mol/l，第三次清洗中的鹽溶液濃度為0.1~0.3?mol/l。
26、優(yōu)選地，鹽溶液的ph為6~8，優(yōu)選為6~7.6，更優(yōu)選為7.2~7.6。
27、優(yōu)選地，所述鹽溶液包括磷酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液、碳酸氫鹽緩沖體系、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液、鉀鹽溶液、鈉鹽溶液、鈣鹽溶液中的至少一種；更優(yōu)選地，所述鹽溶液包括磷酸鹽緩沖本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種脫細(xì)胞基質(zhì)，其特征在于，其制備方法包括：脫細(xì)胞、穩(wěn)定化、交聯(lián)和清洗步驟；所述交聯(lián)包括循環(huán)在交聯(lián)劑溶液中靜置交聯(lián)和在平衡緩沖液體系中超聲平衡，每完成一次交聯(lián)及超聲平衡為一個(gè)循環(huán)過(guò)程；每循環(huán)一次后提高交聯(lián)劑濃度進(jìn)行下一次交聯(lián)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脫細(xì)胞基質(zhì)，其特征在于，初始交聯(lián)劑溶液的濃度為0.05%~0.25%，每循環(huán)一次后提高1%~5%的交聯(lián)劑濃度；優(yōu)選提高1.5%~4%的交聯(lián)劑濃度；
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脫細(xì)胞基質(zhì)，其特征在于，所述交聯(lián)包括先在平衡緩沖液體系中超聲后，循環(huán)在交聯(lián)劑溶液中靜置交聯(lián)和在平衡緩沖液體系中超聲平衡；第一次循環(huán)中交聯(lián)劑溶液的濃度為0.05%~0.25%，第二次循環(huán)中交聯(lián)劑溶液的濃度為2%~3%，第三次循環(huán)中交聯(lián)劑溶液的濃度為5%~6%。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的脫細(xì)胞基質(zhì)，其特征在于，隨著交聯(lián)劑溶液的濃度提高，在交聯(lián)劑溶液中靜置交聯(lián)的時(shí)間逐漸減少。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的脫細(xì)胞基質(zhì)，其特征在于，第一次循環(huán)中靜置交聯(lián)的時(shí)間為15~18h，第二次循環(huán)中靜置交聯(lián)的時(shí)間為1~3h，第三次循環(huán)中靜置
6.根據(jù)權(quán)利要求1~5中任一項(xiàng)所述的脫細(xì)胞基質(zhì)，其特征在于，所述交聯(lián)劑為環(huán)氧化合物、醛類(lèi)、有機(jī)過(guò)氧化物、碳二亞胺中的至少一種；
7.根據(jù)權(quán)利要求1~6中任一項(xiàng)所述的脫細(xì)胞基質(zhì)，其特征在于，所述清洗包括在逐漸降低濃度的鹽溶液中進(jìn)行梯度清洗。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的脫細(xì)胞基質(zhì)，其特征在于，初始清洗的鹽溶液濃度為0.5~1.5mol/L，每次清洗后降低0.2~0.6?mol/L的鹽溶液濃度；優(yōu)選降低0.2~0.5?mol/L的鹽溶液濃度；
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脫細(xì)胞基質(zhì)，其特征在于，所述制備方法采用的原料為水生動(dòng)物源材料，優(yōu)選為水生動(dòng)物組織，較優(yōu)選為魚(yú)類(lèi)的結(jié)締組織、軟體動(dòng)物的軟骨組織或骨組織，更優(yōu)選為魚(yú)類(lèi)的皮膚或軟體動(dòng)物的軟骨組織。
10.根據(jù)權(quán)利要求1~9中任一項(xiàng)所述的脫細(xì)胞基質(zhì)，其特征在于，所述脫細(xì)胞基質(zhì)的拉伸強(qiáng)度為10?MPa~60?MPa；和/或，所述脫細(xì)胞基質(zhì)的孔隙率為90%以上；和/或，所述脫細(xì)胞基質(zhì)的細(xì)胞增殖率為90%以上；和/或，所述脫細(xì)胞基質(zhì)的蛋白含量在75%以上；和/或，所述脫細(xì)胞基質(zhì)中DNA的殘留量低于30ng/mg。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種脫細(xì)胞基質(zhì)，其特征在于，其制備方法包括：脫細(xì)胞、穩(wěn)定化、交聯(lián)和清洗步驟；所述交聯(lián)包括循環(huán)在交聯(lián)劑溶液中靜置交聯(lián)和在平衡緩沖液體系中超聲平衡，每完成一次交聯(lián)及超聲平衡為一個(gè)循環(huán)過(guò)程；每循環(huán)一次后提高交聯(lián)劑濃度進(jìn)行下一次交聯(lián)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脫細(xì)胞基質(zhì)，其特征在于，初始交聯(lián)劑溶液的濃度為0.05%~0.25%，每循環(huán)一次后提高1%~5%的交聯(lián)劑濃度；優(yōu)選提高1.5%~4%的交聯(lián)劑濃度；
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的脫細(xì)胞基質(zhì)，其特征在于，所述交聯(lián)包括先在平衡緩沖液體系中超聲后，循環(huán)在交聯(lián)劑溶液中靜置交聯(lián)和在平衡緩沖液體系中超聲平衡；第一次循環(huán)中交聯(lián)劑溶液的濃度為0.05%~0.25%，第二次循環(huán)中交聯(lián)劑溶液的濃度為2%~3%，第三次循環(huán)中交聯(lián)劑溶液的濃度為5%~6%。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的脫細(xì)胞基質(zhì)，其特征在于，隨著交聯(lián)劑溶液的濃度提高，在交聯(lián)劑溶液中靜置交聯(lián)的時(shí)間逐漸減少。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的脫細(xì)胞基質(zhì)，其特征在于，第一次循環(huán)中靜置交聯(lián)的時(shí)間為15~18h，第二次循環(huán)中靜置交聯(lián)的時(shí)間為1~3h，第三次循環(huán)中靜置交聯(lián)的時(shí)間為0.5~1.5...
【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：馮嬌燕，傅維擎，黃兆輝，趙霄雨，侯哲，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：煙臺(tái)德勝海洋生物科技有限公司，
類(lèi)型：發(fā)明
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