【技術實現步驟摘要】
：本專利技術屬于生物工程，具體涉及一種對正戊醇/正丁醇特異性響應的bmor蛋白突變體，及其在正戊醇檢測或生物傳感器中的應用。
技術介紹
0、
技術介紹
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1、微生物合成的正戊醇/正丁醇是重要的運輸燃料和風味化合物之一，通過代謝工程合成正戊醇/正丁醇在許多微生物宿主中實現，而改造宿主菌株并篩選出高產宿主是實現醇工業化生產的基礎和關鍵。生物傳感器能夠特異性響應目標化合物從而輸出便于檢測的蛋白信號，因而已經被廣泛應用于高通量篩選。但野生型轉錄因子bmor由于其響應特異性差、檢測范圍窄，無法廣泛應用于生物傳感器中。而本專利技術通過蛋白質工程改造得到的bmor蛋白不僅可以實現對正戊醇/正丁醇特異響應，還提高了其底物檢測上限及響應強度，最重要的是可以用于篩選高產菌株從而滿足工業需求。
2、正戊醇/正丁醇長期以來一直被食品工業視為發酵過程中產生的多種風味化合物之一。研究表明，戊醇及其相關的醛、酸和酯是發酵飲料中最豐富的氣味和風味成分，同時已經在多個微生物宿主中實現生物合成，但對正戊醇進行特異篩選仍是一件繁瑣的工程。野生型轉錄因子bmor對底物戊醇(正戊醇和異戊醇)和丁醇(正丁醇和異丁醇)均會產生響應，無法對其中一種醇進行特異響應，從而滿足工業需求。因此實現對醇的特異響應成為一大難題。
3、生物傳感器由分子識別元件和信號轉換器組成。當分子識別元件與被測物體結合時，所產生的信號可以通過轉換器轉換為光信號或電信號，可對被測物進行檢測和分析。作為一種合成生物學新興工具，可以通過設計構建生物傳感器來動態的響應信號分子濃
4、基于轉錄因子(tf)的生物傳感器應用最為廣泛。最常用的轉錄因子是細菌轉錄因子，包括配體結合結構域(lbd)或代謝結合結構域(mbd)和dna結合結構域(dbd)。bmor是假單胞菌正鏈烷烴代謝途徑的轉錄因子，是bebp的成員，用于調節烷烴單加氧酶的σ54依賴型啟動子pbmo，信號分子是c2-c5的直鏈或支鏈醇。但野生型轉錄因子bmor存在響應特異性差，對底物正戊醇、正丁醇、異丁醇等多種高級醇均會產生響應，無法對其中一種醇進行特異響應并產生較高響應值，從而滿足工業需求；以及檢測范圍窄(0-30mm)等問題，無法廣泛應用于生物傳感器中。因此實現對醇的特異響應成并提高檢測范圍成為亟待解決的問題。
5、本專利技術通過蛋白質改造得到的bmor蛋白突變體，不僅可以實現對正戊醇/正丁醇的特異響應，還提高了其底物檢測上限及響應強度，為高效檢測正戊醇/正丁醇快速篩選高產菌株提供了一種解決方案。
技術實現思路
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技術實現思路
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1、本專利技術的目的在于提供一種可以區分正戊醇/正丁醇和其他高級醇的bmor蛋白及生物傳感器和應用，通過對天然bmor的轉錄工作機制及功能區域的分析，分別結合非理性改造的方式以及計算機輔助的半理性設計的方式對bmor進行蛋白質工程改造，最終得到了一種對正戊醇/正丁醇特異性響應的bmor突變體蛋白。
2、進一步地，所述對正戊醇響應高和對正丁醇有響應的bmor突變體蛋白，是在序列表seq?id?no.1所示的野生型bmor蛋白的基礎上發生a117t/f163y突變獲得的，以下簡稱a117t/f163y突變體，所述突變體蛋白具體為：
3、(1)序列表seq?id?no.3所示的氨基酸序列；或
4、(2)seq?id?no.3同源性75％以上的氨基酸序列；或
5、(3)在seq?id?no.3的基礎上進行一個或多個氨基酸替換，和/或缺失，和/或添加后獲得的具有seq?id?no.3相同功能的氨基酸序列。
6、進一步地，本專利技術還提供a117t/f163y突變體的編碼基因；
7、更進一步地，所述編碼基因如序列表seq?id?no.4所示。
8、本專利技術的另一目的是提供a117t/f163y突變體的應用，特別是在檢測含正戊醇/正丁醇的樣品或篩選正戊醇/正丁醇生產菌株中的應用，更特別地，是在構建檢測正戊醇/正丁醇的生物傳感器中的應用；
9、進一步地，所述生物傳感器是基于a117t/f163y突變體的生物傳感器，所述傳感器是包含a117t/f163y突變體編碼基因及其啟動子、啟動子pbmo及報告基因的表達元件；啟動子啟動bmor基因表達，bmor蛋白與醇分子結合形成六聚體，進而啟動下游啟動子pbmo，從而表達報告基因，產生熒光等信號；所述生物傳感器能夠實現在對0-60mm濃度下的正戊醇的高熒光響應和篩選及對0-100mm濃度下的正丁醇的高熒光響應和篩選，進一步應用于工業生產中，實現對含正戊醇/正丁醇的樣品以及正戊醇/正丁醇生產菌株的高熒光響應值篩選；
10、進一步地，所述突變體編碼基因的啟動子包括但不限于pbmor、ptac、pt7、pllaco1等；
11、進一步地，所述報告基因包括但不限于gfp、rfp、cfp、sfgfp、egfp、yfp、ecfp等基因；
12、優選地，所述生物傳感器為包含a117t/f163y突變體編碼基因及其啟動子pbmor、啟動子pbmo及gfp報告基因的重組質粒；進一步地，所述重組質粒可選用的表達載體包括但不限于本領域通用的表達載體；
13、更優選地，所述生物傳感器是將質粒pyh1上的野生型bmor蛋白編碼基因替換為a117t/f163y突變體編碼基因所得，也即，將由pbmor啟動的a117t/f163y突變體編碼基因連接至cole1復制起始位點、ampr和pbmo驅動的gfp基因所得；
14、進一步地，所述菌株包括但不限于大腸桿菌，釀酒酵母，枯草芽孢桿菌等；
15、進一步地，所述啟動子pbmor的核苷酸序列如序列表seq?id?no.5所示；
16、進一步地，所述啟動子pbmo的核苷酸序列如序列表seq?id?no.6所示；
17、進一步地，所述gfp報告基因的核苷酸序列如序列表seq?id?no.7所示。
18、本專利技術還提供上述生物傳感器在正戊醇/正丁醇檢測中的應用，特別是在含有正戊醇/正丁醇的環境、食品、醫學、生物類樣品，或正戊醇/正丁醇生產菌株篩選中的應用，通過將上述質粒導入生產菌株，如大腸桿菌，釀酒酵母，枯草芽孢桿菌等，或單獨的宿主中，如e.coli等，用以檢測正戊醇/正丁醇的產生。
19、有益效果：
20、1、基于bmor的生物傳感器可用于篩選高產正戊醇/正丁醇菌株，但野生型bmor對正戊醇，正丁醇，異戊醇，異丁醇等多種高級醇均具有響應，無法區本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種BmoR突變體蛋白，其特征在于，所述突變體是在序列表SEQ?ID?NO.1所示的野生型BmoR蛋白的基礎上，發生包含A117T/F163Y突變獲得的。
2.如權利要求1所述的BmoR突變體蛋白，其特征在于，所述突變體蛋白具體為：
3.權利要求1所述BmoR突變體在檢測含有正戊醇/正丁醇的樣品，或在篩選正戊醇/正丁醇生產菌株中的應用。
4.權利要求1所述BmoR突變體在構建檢測正戊醇/正丁醇的生物傳感器中的應用。
5.權利要求1所述BmoR突變體的編碼基因。
6.如權利要求5所述的編碼基因，其特征在于，如序列表SEQ?ID?NO.4所示。
7.包含權利要求5所述編碼基因的重組質粒或重組菌株。
8.一種生物傳感器，其特征在于，所述的傳感器是包含權利要求5所述突變體編碼基因、由BmoR突變體激活的啟動子Pbmo、由Pbmo驅動的報告基因和表達BmoR突變體的啟動子的表達元件。
9.如權利要求8所述的生物傳感器，其特征在于，所述報告基因包括但不限于gfp、rfp、cfp、sfgfp、e
10.如權利要求8所述的生物傳感器，其特征在于，表達BmoR突變體的啟動子包括但不限于PbmoR、Ptac、PT7、PLlacO1。
11.如權利要求8所述的生物傳感器，其特征在于，所述傳感器是將由PbmoR啟動的突變體編碼基因連接至colE1復制起始位點、ampr和Pbmo啟動的gfp基因所得。
12.如權利要求8所述的生物傳感器，其特征在于，啟動子Pbmo的核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO.6所示。
13.權利要求8所述生物傳感器在檢測含有正戊醇/正丁醇的環境、食品、醫學、生物類樣品，及篩選生產正戊醇/正丁醇的菌株中的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種bmor突變體蛋白，其特征在于，所述突變體是在序列表seq?id?no.1所示的野生型bmor蛋白的基礎上，發生包含a117t/f163y突變獲得的。
2.如權利要求1所述的bmor突變體蛋白，其特征在于，所述突變體蛋白具體為：
3.權利要求1所述bmor突變體在檢測含有正戊醇/正丁醇的樣品，或在篩選正戊醇/正丁醇生產菌株中的應用。
4.權利要求1所述bmor突變體在構建檢測正戊醇/正丁醇的生物傳感器中的應用。
5.權利要求1所述bmor突變體的編碼基因。
6.如權利要求5所述的編碼基因，其特征在于，如序列表seq?id?no.4所示。
7.包含權利要求5所述編碼基因的重組質粒或重組菌株。
8.一種生物傳感器，其特征在于，所述的傳感器是包含權利要求5所述突變體編碼基因、由bmor突變體激活的啟動子pbmo...
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