【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于及分子生物學及遺傳育種，具體涉及與大豆胞囊線蟲病抗性相關的分子標記、引物組、試劑盒及應用。
技術介紹
1、大豆胞囊線蟲病是大豆上的主要病害之一，嚴重發病時造成減產80%以上，并且嚴重病土4年~5年內不能再種植大豆，對大豆生產危害極大。
2、選用具有抗大豆胞囊線蟲病的新品種大豆可以從根本上解決這一問題。常規的大豆胞囊線蟲抗性的表型鑒定耗時且昂貴，易受環境影響，且對材料根部具有破壞性，移栽植株難存活，導致抗胞囊線蟲的抗源鑒定和抗病新種質培育進展緩慢。相對于表型精準鑒定，通過分子標記輔助選擇既能夠避免抗病鑒定對品種根系造成的破壞性，又兼具高效、低成本的優點。與整個大豆基因組相比，當前開發出的功能性標記較少，鑒定效率低。距離主效位點rhg1僅0.4?cm的satt309是抗大豆胞囊線蟲早期分子標記輔助選擇中應用最廣泛的分子標記，其缺點是不能高通量檢測，且只能對抗病peking型材料選，無法區分抗病材料pi88788和感病材料lee。無論是ssr、indel還是caps標記，皆存在通量小、費用高的問題，無法達到高通量檢測的要求，在分子標記輔助選擇應用中具有局限性。
3、kasp?(kompetitive?allele?specific?pcr)是具有低成本、高通量特點的新型基因分型技術，通過引物末端堿基的特異匹配來對snp以及indel位點進行精準的雙等位基因分型，在水稻、小麥、大豆等作物的分子標記輔助選擇中得到廣泛應用。然而，目前針對大豆抗胞囊線蟲性狀開發的kasp標記多集中在rhg1和rhg4兩個
技術實現思路
1、針對上述現有技術中存在的技術問題，本專利技術的目的是提供與大豆胞囊線蟲病抗性相關的分子標記、引物組、試劑盒及應用，本專利技術提供的分子標記scn15.2、scn18.1和scn18.2、擴增分子標記的引物組及試劑盒可用于抗胞囊線蟲大豆品種的鑒定、輔助篩選和突變體育種。
2、本專利技術第一方面提供了一種與大豆胞囊線蟲病抗性相關的分子標記，所述分子標記為scn15.2、scn18.1和scn18.2中的至少一種，分子標記scn15.2的核苷酸序列如seq?idno.1所示，在此序列的49bp處具有a/g多態性；分子標記scn18.1的核苷酸序列如seq?idno.2所示，在此序列的50bp處具有c/t多態性；分子標記scn18.2的核苷酸序列如seq?idno.3所示，在此序列的63bp處具有a/t多態性。
3、進一步地，所述scn15.2與qtl位點qscn3-15緊密關聯，所述scn18.1和scn18.2與qtl位點qscn3-18緊密關聯。
4、進一步地，所述qscn3-15位于在大豆第15連鎖群的117.54?cm~118.278?cm區間內，所述qscn3-18位于在大豆第18連鎖群的0?cm~0.495?cm區間內。
5、本專利技術第二方面提供了一種擴增所述與大豆胞囊線蟲病抗性相關的分子標記的引物組，所述引物組是由兩條特異引物以及一條反向通用引物組成；擴增scn15.2的兩條特異引物的核苷酸序列分別如seq?id?no.4和seq?id?no.5所示、反向通用引物的核苷酸序列如seq?id?no.6所示；擴增scn18.1的兩條特異引物的核苷酸序列分別如seq?id?no.7和seqid?no.8所示、反向通用引物的核苷酸序列如seq?id?no.9所示；擴增scn18.2的兩條特異引物的核苷酸序列分別如seq?id?no.10和seq?id?no.11所示、反向通用引物的核苷酸序列如seq?id?no.12所示。
6、本專利技術第三方面提供了一種試劑盒，所述試劑盒包含所述擴增scn15.2的引物組、擴增scn18.1的引物組和擴增scn18.2的引物組中的任意一種或幾種。
7、本專利技術第四方面提供了一種所述與大豆胞囊線蟲病抗性相關的分子標記或所述引物組在鑒定抗胞囊線蟲大豆品種中的應用。
8、本專利技術第五方面提供了一種所述與大豆胞囊線蟲病抗性相關的分子標記或所述引物組在輔助篩選抗胞囊線蟲大豆品種中的應用。
9、進一步地，所述與大豆胞囊線蟲病抗性相關的分子標記或所述引物組用于抗胞囊線蟲大豆品種的突變體育種。
10、本專利技術第六方面提供了一種抗胞囊線蟲大豆品種的鑒定方法，包括以下步驟：
11、提取待測大豆的dna；
12、利用所述擴增scn15.2的引物組、擴增scn18.1的引物組或擴增scn18.2的引物組中的任一種對提取的待測大豆dna進行pcr擴增，獲得pcr產物；
13、檢測pcr產物在多態性位點處的基因分型，根據基因分型結果判定待測大豆是否為抗胞囊線蟲大豆品種。
14、進一步地，當所述scn15.2的多態性位點處的基因型為gg時，判定待測大豆樣本為抗胞囊線蟲大豆品種；或當所述scn18.1的多態性位點處的基因型為cc時，判定待測大豆樣本為抗胞囊線蟲大豆品種；或當所述scn18.2的多態性位點處的基因型為aa時，判定待測大豆樣本為抗胞囊線蟲大豆品種。
15、進一步地，每1?μl?pcr擴增反應體系中包括：dna模板4ng、2×kasp?master?mix0.5?μl、72×assay?mix?0.014?μl，去離子水補足；其中72×kasp?assay?mix是由兩條特異引物和一條反向通用引物組成，兩條特異引物的濃度均為0.168?μm，反向通用引物的濃度為0.42?μm。
16、進一步地，所述pcr擴增的反應程序如下：（1）熱激活；（2）變性94℃，20?s；退火：61℃~55℃，60?s；每個循環降低0.6℃，共10個循環；（3）變性：94℃，20?s；退火：55℃，60?s；共26個循環。
17、綜上，與現有技術相比，本專利技術具有以下有益優點及效果：
18、（1）本專利技術開發了3個與大豆抗胞囊線蟲性狀相關分子標記scn15.2、scn18.1和scn18.2，并提供了用于擴增分子標記的引物組及試劑盒，本專利技術提供的分子標記、引物組及試劑盒可以用于輔助篩選或鑒定抗胞囊線蟲大豆品種，其中分子標記scn15.2的鑒定效率達66.7%，分子標記scn18.1的鑒定效率達80%，分子標記scn18.2的鑒定效率達69.2%，并且scn15.2與scn18.1兩個分子標記聯合鑒定效率為95.2%，scn15.2、scn18.1和scn18.2三個分子標記聯合鑒定時，鑒定效率高達100%。
19、（2）本專利技術提供的兩個與大豆胞囊線蟲病抗性相關的qtl位點的lod值域大于5.730，最大lod值為12.033，qscn3-15和qscn3-18對表型的貢獻率分別為20.731%和24.476%，可輔助挖掘相關功能基因。本專利技術還提供了一種鑒定抗胞囊線蟲大豆本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種與大豆胞囊線蟲病抗性相關的分子標記，其特征在于，所述分子標記為SCN15.2、SCN18.1和SCN18.2中的至少一種，
2.一種擴增權利要求1所述的與大豆胞囊線蟲病抗性相關的分子標記的引物組，其特征在于，所述引物組是由兩條特異引物以及一條反向通用引物組成；
3.一種試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含權利要求2中所述的擴增SCN15.2的引物組、擴增SCN18.1的引物組和擴增SCN18.2的引物組中的任意一種或幾種。
4.一種權利要求1所述的與大豆胞囊線蟲病抗性相關的分子標記或權利要求2所述的引物組在鑒定抗胞囊線蟲大豆品種中的應用。
5.一種權利要求1所述的與大豆胞囊線蟲病抗性相關的分子標記或權利要求2所述的引物組在輔助篩選抗胞囊線蟲大豆品種中的應用。
6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，所述分子標記或所述引物組用于抗胞囊線蟲大豆品種的突變體育種。
7.一種抗胞囊線蟲大豆品種的鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟：
8.根據權利要求7所述的抗胞囊線蟲大豆品種的鑒定方法，其特征在于，
9.根據權利要求7所述的抗胞囊線蟲大豆品種的鑒定方法，其特征在于，每1?μL?PCR擴增反應體系中包括：DNA模板?4ng、2×KASP?Master?mix?0.5?μL、72×Assay?mix?0.014?μL，去離子水補足；其中72×KASP?Assay?Mix是由兩條特異引物和一條反向通用引物組成，兩條特異引物的濃度均為0.168?μM，反向通用引物的濃度為0.42?μM。
10.根據權利要求7所述的抗胞囊線蟲大豆品種的鑒定方法，其特征在于，所述PCR擴增的反應程序如下：（1）熱激活；（2）變性94℃，20?s；退火：61℃~55℃，60s；每個循環降低0.6℃，共10個循環；（3）變性：94℃，20s；退火：55℃，60s；共26個循環。
...【技術特征摘要】
1.一種與大豆胞囊線蟲病抗性相關的分子標記，其特征在于，所述分子標記為scn15.2、scn18.1和scn18.2中的至少一種，
2.一種擴增權利要求1所述的與大豆胞囊線蟲病抗性相關的分子標記的引物組，其特征在于，所述引物組是由兩條特異引物以及一條反向通用引物組成；
3.一種試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含權利要求2中所述的擴增scn15.2的引物組、擴增scn18.1的引物組和擴增scn18.2的引物組中的任意一種或幾種。
4.一種權利要求1所述的與大豆胞囊線蟲病抗性相關的分子標記或權利要求2所述的引物組在鑒定抗胞囊線蟲大豆品種中的應用。
5.一種權利要求1所述的與大豆胞囊線蟲病抗性相關的分子標記或權利要求2所述的引物組在輔助篩選抗胞囊線蟲大豆品種中的應用。
6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，所述分子標記或所述引物組用于抗胞囊線蟲大豆品種的突變體育種。
【專利技術屬性】
技術研發人員：顏秀娟，邱強，于維，李明姝，劉金文，張鳴浩，董青松，趙胤凱，張偉，徐研，袁翠平，趙婧，孟凡鋼，饒德民，于德斌，程彤，王曉慧，袁明，叢博韜，時彥，于馥荔，鮑慶超，鞠金明，
申請(專利權)人：吉林省農業科學院中國農業科技東北創新中心，
類型：發明
國別省市：
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