【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
【國外來華專利技術(shù)】
本公開涉及具有大斯托克斯位移(lss)和熱穩(wěn)定熒光的新穎并且容易獲得的熒光化合物，該熒光化合物用于擴展基于熒光的核酸檢測技術(shù)的多重能力。
技術(shù)介紹
1、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)已成為生物醫(yī)學(xué)研究、疾病監(jiān)測和診斷中普遍存在的工具。通過pcr進行的核酸序列的擴增描述于美國專利號4,683,195、4,683,202和4,965,188中?，F(xiàn)在，pcr在本領(lǐng)域中是眾所周知的，并且已經(jīng)在科學(xué)文獻中進行了廣泛的描述。參見pcrapplications，((1999)innis等人編輯，academic?press，san?diego)、pcr?strategies，((1995)innis等人編輯，academic?press，san?diego)；pcr?protocols，((1990)innis等人編輯，academic?press，san?diego)以及pcr?technology，((1989)erlich編，stocktonpress，new?york)?！皩崟r”pcr測定能夠同時對靶序列的起始量進行擴增和檢測和/或定量。利用dna聚合酶的5′至3′核酸酶活性的基本實時pcr測定描述于holland等人，(1991)proc.natl.acad.sci.88：7276-7280和美國專利號5,210,015中。在美國專利公開號20100143901a1中已描述了不具有核酸酶活性的實時pcr(無核酸酶測定)。在美國專利號5,538,848中描述了熒光探針在實時pcr中的使用。
2、帶有熒光探針的典型的實時pcr方案
3、然而，實時測定的主要挑戰(zhàn)仍然是在單管中分析許多靶標(biāo)的能力。在醫(yī)學(xué)和診斷學(xué)的幾乎每個領(lǐng)域，目標(biāo)基因座的數(shù)量都在迅速增加。例如，在法醫(yī)dna鑒定、病原微生物檢測、多基因座遺傳病篩查和多基因表達研究等中，必須對多個基因座進行分析。
4、商業(yè)的基于熒光的自動化聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)裝置可以通過從不同顏色的熒光團區(qū)分光來檢測單個反應(yīng)器皿中的多個靶標(biāo)(多重測定)。染料以最大限度地減少其光譜重疊的方式進行選擇。集合中的每個熒光團能夠在吸收最大值或附近被光激發(fā)，并且在熒光最大值或附近檢測到發(fā)射光(熒光)。通過光學(xué)濾波器限制激發(fā)和發(fā)射的波長(帶)范圍，可以區(qū)分單個熒光團。激發(fā)帶和同時檢測到的發(fā)射帶的特定組合定義了光學(xué)通道，每個通道允許鑒別一個pcr靶標(biāo)。
5、可實現(xiàn)的光學(xué)通道的最大數(shù)量取決于許多相互關(guān)聯(lián)的因素，諸如可用光譜范圍、激發(fā)光強度、熒光團亮度、熒光團光譜寬度、濾波器帶寬和檢測因子靈敏度。最先進的基于熒光檢測技術(shù)的pcr裝置每個激發(fā)和發(fā)射途徑使用四至六個光學(xué)濾波器。因此，利用標(biāo)準(zhǔn)熒光團，可以區(qū)分四至六個單獨的pcr靶標(biāo)。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本公開涉及具有大斯托克斯位移的染料，諸如約50nm或更大、約60nm或更大、約70nm或更大、約80nm或更大、約90nm或更大的斯托克斯位移等)。本文中，已經(jīng)確定將特定接頭部分摻入本公開的染料中允許容易地調(diào)節(jié)其光譜性質(zhì)，諸如其激發(fā)和發(fā)射波長。此外，通過選擇合適的接頭部分，本公開的染料可以轉(zhuǎn)化為其各自的活化衍生物，諸如其各自的nhs-酯；或被修飾以摻入能夠參與用于生物分子標(biāo)記的點擊化學(xué)化學(xué)反應(yīng)的官能團。此外，保護基團的引入允許染料衍生成亞磷酰胺，諸如與核酸固相合成和亞磷酰胺化學(xué)相容的那些。
2、此外，已經(jīng)確定本公開的染料與熱穩(wěn)定熒光組合表現(xiàn)出優(yōu)異的亮度。還令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，本公開的染料可以在單一的、高產(chǎn)率的反應(yīng)步驟中容易地從廉價的起始材料獲得。這些益處和其他益處在本文中進一步描述。
3、本公開的第一方面是一種化合物，其具有式(i)：
4、
5、其中
6、r1為h或保護基團；
7、r2為經(jīng)-me、-et、-co2-、-co2-(硫醇反應(yīng)性基團)、-co2-(胺反應(yīng)性基團)、-co2-(羧基反應(yīng)性基團)、-c2-co2-、-c2-co2-(硫醇反應(yīng)性基團)、-c2-co2-(胺反應(yīng)性基團)、-c2-co2-(羧基反應(yīng)性基團)、-oh、-亞磷酰胺、-o-亞磷酰胺、-d、鹵素或能夠參與“點擊化學(xué)”反應(yīng)的基團中的一者或多者取代的c1-c8支鏈或非支鏈烷基、支鏈或非支鏈雜烷基或者環(huán)烷基基團；并且
8、[x]-為抗衡陰離子，條件是當(dāng)r2具有負(fù)電荷時，[x]-不存在。
9、在一些實施例中，r1為9-芴基甲基氨基甲酸酯、叔丁基氨基甲酸酯、芐基氨基甲酸酯、乙酰胺、三氟乙酰胺、芐胺、三苯基甲胺、單甲氧基三苯甲基(mmt)、dms和對甲苯磺酰胺。在一些實施例中，r1為h。在一些實施例中，r2的第一碳原子為伯碳原子。在一些實施例中，r2的第一碳原子為仲碳原子。在一些實施例中，r2的第一碳原子為叔碳原子。在一些實施例中，能夠參與該“點擊化學(xué)反應(yīng)”的基團選自由以下項組成的組：二環(huán)[6.1.0]壬炔)基團(“bcn”)、二苯并環(huán)辛炔(“dbco”)、烯烴、反式環(huán)辛烯(“tco”)、馬來酰亞胺、醛、酮、疊氮化物、四嗪、硫醇、1，3-硝酮、肼和羥胺。在一些實施例中，能夠參與“點擊化學(xué)反應(yīng)”的基團為dbco、tco或疊氮化物。在一些實施例中，硫醇反應(yīng)性基團選自由以下項組成的組：鹵代乙酰基、馬來酰亞胺、碘乙酰胺、氮雜環(huán)丙烷、丙烯?；?、芳基化劑、乙烯基砜、甲烷硫代磺酸酯、吡啶基二硫化物和tnb-硫醇。在一些實施例中，硫醇反應(yīng)性基團為馬來酰亞胺。在一些實施例中，胺反應(yīng)性基團選自由以下項組成的組：nhs酯、異硫氰酸酯、?；B氮化物、磺酰氯、磺基二氯苯酚、五氟苯酚、四氟苯酚、4-磺基-2,3，5，6-四氟苯基、醛、乙二醛、環(huán)氧化物、環(huán)氧乙烷、碳酸酯、芳基鹵、氟苯酚酯、磺基氯苯酚、碳二亞胺、鄰苯二甲酰亞胺、苯并三唑、酰亞胺酯和酸酐。在一些實施例中，羰基反應(yīng)性基團選自由以下項組成的組：肼、肼衍生物和胺。在一些實施例中，r2選自由以下項組成的組：經(jīng)-co2-馬來酰亞胺或-c2-co2-馬來酰亞胺取代的1-c8支鏈或非支鏈烷基、支鏈或非支鏈雜烷基或者環(huán)烷基基團；經(jīng)-co2-nhs酯或-c2-co2-nhs酯取代的c1-c8支鏈或非支鏈烷基、支鏈或非支鏈雜烷基或者環(huán)烷基基團；以及經(jīng)-co2-肼或-c2-co2-肼取代的c1-c8支鏈或非支鏈烷基、支鏈或非支鏈雜烷基或者環(huán)烷基基團。在一些實施例中，r2為經(jīng)-me、-et、-co2-、-co2-(硫醇反應(yīng)性基團)、-co2-(胺反應(yīng)性基團)、-co2-(羧基反應(yīng)性基團)、-c2-co2-、-c2-co2-(硫醇反應(yīng)性基團)、-c2-co2-(胺反應(yīng)性基團)、-c2-co2-(羧基反應(yīng)性基團)、-oh、-亞磷酰胺、-o-亞磷酰胺、-d、鹵素或能夠參與“點擊化學(xué)”反應(yīng)的基團中的一者或多者取代的c1-c6支鏈或非支鏈烷基、支鏈或非支鏈雜烷本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
1.一種化合物，其具有式(I)：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中所述硫醇反應(yīng)性基團選自由以下項組成的組：鹵代乙?；ⅠR來酰亞胺、碘乙酰胺、氮雜環(huán)丙烷、丙烯酰基、芳基化劑、乙烯基砜、甲烷硫代磺酸酯、吡啶基二硫化物和TNB-硫醇。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中所述胺反應(yīng)性基團選自由以下項組成的組：NHS酯、異硫氰酸酯、?；B氮化物、磺酰氯、磺基二氯苯酚、五氟苯酚、四氟苯酚、4-磺基-2,3,5,6-四氟苯基、醛、乙二醛、環(huán)氧化物、環(huán)氧乙烷、碳酸酯、芳基鹵、氟苯酚酯、磺基氯苯酚、碳二亞胺、鄰苯二甲酰亞胺、苯并三唑、酰亞胺酯和酸酐。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中羰基反應(yīng)性基團選自由以下項組成的組：肼、肼衍生物和胺。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的化合物，其中R2選自由以下項組成的組：經(jīng)–CO2–馬來酰亞胺或–C2–CO2–馬來酰亞胺取代的C1-C8支鏈或非支鏈烷基、支鏈或非支鏈雜烷基或者環(huán)烷基基團；經(jīng)–CO2–NHS酯或–C2–CO2–NHS酯取代的C1-C8支鏈或非支鏈烷基、支鏈或非支鏈雜烷基或者環(huán)烷基基團；以
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中能夠參與“點擊化學(xué)反應(yīng)”的所述基團選自由以下項組成的組：二環(huán)[6.1.0]壬炔)基團(“BCN”)、二苯并環(huán)辛炔(“DBCO”)、烯烴、反式環(huán)辛烯(“TCO”)、馬來酰亞胺、醛、酮、疊氮化物、四嗪、硫醇、1,3-硝酮、肼和羥胺。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的化合物，其中R2為經(jīng)BCN、DBCO或TCO取代的C1-C6支鏈或非支鏈烷基基團。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中R2為經(jīng)–Me、–Et、–CO2-、–OH、–D或鹵素中的一者或多者取代的C1-C6支鏈或非支鏈烷基基團；或者
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中R1為保護基團；并且其中R2包括–亞磷酰胺或–O–亞磷酰胺。
10.一種化合物，其選自由以下項組成的組：
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的化合物，其中[X]-選自由以下項組成的組：氯離子、溴離子、碘離子、硫酸根、苯磺酸根、對甲苯磺酸根、對溴苯磺酸根、甲磺酸根、三氟甲磺酸根、磷酸根、高氯酸根、四氟硼酸根、六氟磷酸根、四苯基硼化物離子、硝酸根以及芳香族或脂肪族羧酸的陰離子。
12.一種化合物，其選自由以下項組成的組：
13.一種化合物，其具有式(IA)：
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的化合物，其中R2選自由以下項組成的組：經(jīng)–CO2–馬來酰亞胺或–C2–CO2–馬來酰亞胺取代的C1-C8支鏈或非支鏈烷基、支鏈或非支鏈雜烷基或者環(huán)烷基基團；經(jīng)–CO2–NHS酯或–C2–CO2–NHS酯取代的C1-C8支鏈或非支鏈烷基、支鏈或非支鏈雜烷基或者環(huán)烷基基團；以及經(jīng)–CO2–肼或–C2–CO2–肼取代的C1-C8支鏈或非支鏈烷基、支鏈或非支鏈雜烷基或者環(huán)烷基基團；或者
15.根據(jù)權(quán)利要求13至14中任一項所述的化合物，其中所述化合物具有至少約70nm的斯托克斯位移。
16.根據(jù)權(quán)利要求13至15中任一項所述的化合物，其中所述化合物在約25℃至約100℃的溫度范圍內(nèi)是熱穩(wěn)定的。
17.一種綴合物，其包含(i)特異性結(jié)合實體以及(ii)來源于根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項所述的化合物的染料部分。
18.一種具有式(II)的綴合物：
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的綴合物，其中Y為具有在2個與約25個之間的碳原子并且任選地具有一個或多個選自O(shè)、N或S的雜原子的支鏈或非支鏈、直鏈或環(huán)狀、取代或未取代、飽和或不飽和的基團。
20.根據(jù)權(quán)利要求18至19中任一項所述的綴合物，其中Y具有式(IIIC)的結(jié)構(gòu)：
21.一種具有式(IIC)或(IID)中的任一者的綴合物：
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的綴合物，其中R3的第一碳原子為伯碳原子；或者
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的綴合物，其中R1為H；并且R3為經(jīng)–Me、–Et、–D、–C2–CO2–、–CO2–和–OH–中的一者或多者取代的C1-C8烷基、雜烷基或環(huán)烷基基團。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的綴合物，其中Y為具有在2個與30個之間的碳原子并且任選地具有一個或多個選自O(shè)、N或S的雜原子的支鏈或非支鏈、直鏈或環(huán)狀、取代或未取代、飽和或不飽和的基團。
25.一種試劑盒，其包括：(i)第一綴合物，其包含偶聯(lián)至來源于根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項所述的化合物...
【技術(shù)特征摘要】
【國外來華專利技術(shù)】
1.一種化合物，其具有式(i)：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中所述硫醇反應(yīng)性基團選自由以下項組成的組：鹵代乙?；ⅠR來酰亞胺、碘乙酰胺、氮雜環(huán)丙烷、丙烯?；?、芳基化劑、乙烯基砜、甲烷硫代磺酸酯、吡啶基二硫化物和tnb-硫醇。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中所述胺反應(yīng)性基團選自由以下項組成的組：nhs酯、異硫氰酸酯、?；B氮化物、磺酰氯、磺基二氯苯酚、五氟苯酚、四氟苯酚、4-磺基-2,3,5,6-四氟苯基、醛、乙二醛、環(huán)氧化物、環(huán)氧乙烷、碳酸酯、芳基鹵、氟苯酚酯、磺基氯苯酚、碳二亞胺、鄰苯二甲酰亞胺、苯并三唑、酰亞胺酯和酸酐。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中羰基反應(yīng)性基團選自由以下項組成的組：肼、肼衍生物和胺。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的化合物，其中r2選自由以下項組成的組：經(jīng)–co2–馬來酰亞胺或–c2–co2–馬來酰亞胺取代的c1-c8支鏈或非支鏈烷基、支鏈或非支鏈雜烷基或者環(huán)烷基基團；經(jīng)–co2–nhs酯或–c2–co2–nhs酯取代的c1-c8支鏈或非支鏈烷基、支鏈或非支鏈雜烷基或者環(huán)烷基基團；以及經(jīng)–co2–肼或–c2–co2–肼取代的c1-c8支鏈或非支鏈烷基、支鏈或非支鏈雜烷基或者環(huán)烷基基團。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中能夠參與“點擊化學(xué)反應(yīng)”的所述基團選自由以下項組成的組：二環(huán)[6.1.0]壬炔)基團(“bcn”)、二苯并環(huán)辛炔(“dbco”)、烯烴、反式環(huán)辛烯(“tco”)、馬來酰亞胺、醛、酮、疊氮化物、四嗪、硫醇、1,3-硝酮、肼和羥胺。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的化合物，其中r2為經(jīng)bcn、dbco或tco取代的c1-c6支鏈或非支鏈烷基基團。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中r2為經(jīng)–me、–et、–co2-、–oh、–d或鹵素中的一者或多者取代的c1-c6支鏈或非支鏈烷基基團；或者
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中r1為保護基團；并且其中r2包括–亞磷酰胺或–o–亞磷酰胺。
10.一種化合物，其選自由以下項組成的組：
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的化合物，其中[x]-選自由以下項組成的組：氯離子、溴離子、碘離子、硫酸根、苯磺酸根、對甲苯磺酸根、對溴苯磺酸根、甲磺酸根、三氟甲磺酸根、磷酸根、高氯酸根、四氟硼酸根、六氟磷酸根、四苯基硼化物離子、硝酸根以及芳香族或脂肪族羧酸的陰離子。
12.一種化合物，其選自由以下項組成的組：
13.一種化合物，其具有式(ia)：
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的化合物，其中r2選自由以下項組成的組：經(jīng)–co2–馬來酰亞胺或–c2–co2–馬來酰亞胺取代的c1-c8支鏈或非支鏈烷基、支鏈或非支鏈雜烷基或者環(huán)烷基基團；經(jīng)–co2–nhs酯或–c2–co2–nhs酯取代的c1-c8支鏈或非支鏈烷基、支鏈或非支鏈雜烷基或者環(huán)烷基基團；以及經(jīng)–co2–肼或–c2–co2–肼取代的c1-c8支鏈或非支鏈烷基、支鏈或非支鏈雜烷基或者環(huán)烷基基團；或者
15.根據(jù)權(quán)利要求13至14中任一項所述的化合物，其中所述化合物具有至少約70nm的斯托克斯位移。
16.根據(jù)權(quán)利要求13至15中任一項所述的化合物，其中所述化合物在約25℃至約100℃的溫度范圍內(nèi)是熱穩(wěn)定的。
17.一種綴合物，其包含(i)特異性結(jié)合實體以及(ii)來源于根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項所述的化合物的染料部分。
18.一種具有式(ii)的綴合物：
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的綴合物...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：A·尼爾斯，
申請(專利權(quán))人：豪夫邁·羅氏有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
還沒有人留言評論。發(fā)表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。