【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物大分子檢測，具體為一種可長期保存的磷酸化蛋白分離電泳用預制膠。
技術介紹
1、蛋白質的大多數調控機制是通過蛋白質的構象變化介導的，而構象變化通常是通過變構效應和蛋白質一級結構上的各種共價修飾來介導的。蛋白質的磷酸化和去磷酸化的可逆反應，是機體內最常見、最重要的翻譯后修飾之一。它涉及到細胞信號傳導、細胞分化與生長、細胞代謝與凋亡等生理過程。此外，這種磷酸化與去磷酸化在疾病相關的代謝系統中起著重要的作用，異常磷酸化和去磷酸化是細胞癌變的原因之一。探究蛋白質的磷酸化－非磷酸化狀態不僅有利于研究組織細胞中基因表達和酶活性，更有助于疾病的診斷和治療。
2、然而，傳統的預制膠只能按蛋白質的分子量進行分離，無法區分磷酸化和非磷酸化蛋白，這在一定程度上限制了磷酸化蛋白檢測的效率和分離效果。
技術實現思路
1、針對現有技術的不足，本專利技術提供了一種可長期保存的磷酸化蛋白分離電泳用預制膠，解決傳統的預制膠只能按蛋白質的分子量進行分離，無法區分磷酸化和非磷酸化蛋白的問題。
2、為實現以上目的，本專利技術通過以下技術方案予以實現：一種可長期保存的磷酸化蛋白分離電泳用預制膠，包括聚丙烯酰胺預制膠，所述聚丙烯酰胺預制膠包含能夠與磷酸化基團特異結合的雙核金屬絡合物，所述雙核金屬絡合物為化合物t67772，所述聚丙烯酰胺預制膠添加有二價金屬離子，所述二價金屬離子為鋅離子或錳離子。
3、優選的，所述二價金屬離子在聚丙烯酰胺預制膠中的濃度為化合物t67772的兩
4、優選的，所述化合物t67772在聚丙烯酰胺預制膠中的濃度范圍為10～300微摩爾。
5、優選的，所述聚丙烯酰胺預制膠由上層的濃縮膠和下層的分離膠組成，所述化合物t67772和二價金屬離子添加在下層的分離膠中。
6、優選的，一種可長期保存的磷酸化蛋白分離電泳用預制膠的制備方法，包括以下步驟：
7、s1、配制丙烯酰胺溶液，將丙烯酰胺粉末和甲叉雙丙烯酰胺粉末溶于超純水中，定容至100毫升，過濾備用；
8、s2、配制分離膠，將丙烯酰胺溶液、緩沖體系、雙核金屬絡合物溶液、二價金屬離子溶液、超純水和過硫酸銨溶液混合，臨灌膠前加入四甲基乙二胺，混合均勻，迅速灌膠得到分離膠，在分離膠上層加入超純水壓膠，待凝固后去除；
9、s3、配制濃縮膠，將丙烯酰胺溶液、緩沖體系、超純水和過硫酸銨溶液混合，臨灌膠前加入四甲基乙二胺，混合均勻，迅速灌膠得到濃縮膠，在濃縮膠上插入梳子，待凝固后取出。
10、優選的，所述s1步驟中，稱取28—30克丙烯酰胺粉末和0.8—1.2克甲叉雙丙烯酰胺粉末，溶于超純水中，定容至100毫升，使用0.45-0.50微米濾膜過濾后備用。
11、優選的，所述s2步驟中，取3-3.5毫升丙烯酰胺溶液、0.8-1.2毫升緩沖體系、150-250微升5毫摩爾化合物t67772溶液、150-250微升10毫摩爾zncl2溶液、5-5.5毫升超純水和60-80微升過硫酸銨溶液混合、臨灌膠前加入4-6微升四甲基乙二胺，混合均勻，迅速灌膠，灌膠后加入超純水壓膠，等待凝固后去除分離膠上層的超純水。
12、優選的，所述s3步驟中，取0.5-0.7毫升丙烯酰胺溶液，0.3-0.5毫升緩沖體系、2.8-3.0毫升超純水和25-35微升10％過硫酸銨溶液，臨灌膠前加入1-3微升四甲基乙二胺，混合均勻，迅速灌膠，灌膠后在濃縮膠上插入梳子，凝固后即得到預制膠，保存于緩沖體系溶液中，在2～8℃的溫度下進行冷藏保存。
13、優選的，所述緩沖體系為三羥甲基氨基甲烷-甘氨酸、雙(2-羥乙基)氨基(三羥甲基)甲烷或hepes-三羥甲基氨基甲烷，緩沖體系的酸堿度為中性。
14、本專利技術提供了一種可長期保存的磷酸化蛋白分離電泳用預制膠。
15、具備以下有益效果：
16、1、本專利技術通過在預制膠中加入雙核金屬絡合物(化合物t67772)和二價金屬離子(如鋅離子或錳離子)，該預制膠能夠特異性地結合磷酸化蛋白質中的磷酸基團，使磷酸化蛋白的遷移率顯著降低，從而與非磷酸化蛋白實現有效分離，這種特異性結合的方式確保了磷酸化和非磷酸化蛋白的遷移差異，實現不同磷酸化數目和位點的蛋白質亞型的分離。
17、2、本專利技術不需要使用放射性同位素標記或磷酸化抗體進行檢測，避免了對實驗人員健康的風險和高昂的抗體成本，且減少了操作復雜度。
18、3、本專利技術預制膠經過冷藏保存，能夠保持長達12個月的穩定性，避免了頻繁制備凝膠的需要，方便實驗室管理，降低了實驗成本和時間投入。
19、4、本專利技術預制膠可以直接用于常規sds-page電泳操作，無需額外復雜的預處理步驟，其緩沖體系的ph值為中性，有助于在變性條件下提供穩定的電泳環境，中性ph降低了預制膠中聚丙烯酰胺三維網狀結構降解的速度。
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1.一種可長期保存的磷酸化蛋白分離電泳用預制膠，其特征在于，包括聚丙烯酰胺預制膠，所述聚丙烯酰胺預制膠包含能夠與磷酸化基團特異結合的雙核金屬絡合物，所述雙核金屬絡合物為化合物T67772，所述聚丙烯酰胺預制膠添加有二價金屬離子，所述二價金屬離子為鋅離子或錳離子。
2.根據權利要求1所述的可長期保存的磷酸化蛋白分離電泳用預制膠，其特征在于，所述二價金屬離子在聚丙烯酰胺預制膠中的濃度為化合物T67772的兩倍。
3.根據權利要求1所述的可長期保存的磷酸化蛋白分離電泳用預制膠，其特征在于，所述化合物T67772在聚丙烯酰胺預制膠中的濃度范圍為10～300微摩爾。
4.根據權利要求1所述的可長期保存的磷酸化蛋白分離電泳用預制膠，其特征在于，所述聚丙烯酰胺預制膠由上層的濃縮膠和下層的分離膠組成，所述化合物T67772和二價金屬離子添加在下層的分離膠中。
5.一種可長期保存的磷酸化蛋白分離電泳用預制膠的制備方法，其特征在于，用于權利要求1-4任一項所述的可長期保存的磷酸化蛋白分離電泳用預制膠，包括以下步驟：
6.根據權利要求5所述的
7.根據權利要求5所述的可長期保存的磷酸化蛋白分離電泳用預制膠的制備方法，其特征在于，所述S2步驟中，取3-3.5毫升丙烯酰胺溶液、0.8-1.2毫升緩沖體系、150-250微升5毫摩爾化合物T67772溶液、150-250微升10毫摩爾ZnCl2溶液、5-5.5毫升超純水和60-80微升過硫酸銨溶液混合、臨灌膠前加入4-6微升四甲基乙二胺，混合均勻，迅速灌膠得到分離膠，灌膠后加入超純水壓膠，等待凝固后去除分離膠上層的超純水。
8.根據權利要求5所述的可長期保存的磷酸化蛋白分離電泳用預制膠的制備方法，其特征在于，所述S3步驟中，取0.5-0.7毫升丙烯酰胺溶液，0.3-0.5毫升緩沖體系、2.8-3.0毫升超純水和25-35微升10％過硫酸銨溶液，臨灌膠前加入1-3微升四甲基乙二胺，混合均勻，迅速灌膠得到濃縮膠，灌膠后在濃縮膠上插入梳子，凝固后取出，即得到預制膠，保存于緩沖體系溶液中，在2～8℃的溫度下進行冷藏保存。
9.根據權利要求5所述的可長期保存的磷酸化蛋白分離電泳用預制膠的制備方法，其特征在于，所述緩沖體系為三羥甲基氨基甲烷-甘氨酸、雙(2-羥乙基)氨基(三羥甲基)甲烷或HEPES-三羥甲基氨基甲烷，緩沖體系的酸堿度為中性。
...【技術特征摘要】
1.一種可長期保存的磷酸化蛋白分離電泳用預制膠，其特征在于，包括聚丙烯酰胺預制膠，所述聚丙烯酰胺預制膠包含能夠與磷酸化基團特異結合的雙核金屬絡合物，所述雙核金屬絡合物為化合物t67772，所述聚丙烯酰胺預制膠添加有二價金屬離子，所述二價金屬離子為鋅離子或錳離子。
2.根據權利要求1所述的可長期保存的磷酸化蛋白分離電泳用預制膠，其特征在于，所述二價金屬離子在聚丙烯酰胺預制膠中的濃度為化合物t67772的兩倍。
3.根據權利要求1所述的可長期保存的磷酸化蛋白分離電泳用預制膠，其特征在于，所述化合物t67772在聚丙烯酰胺預制膠中的濃度范圍為10～300微摩爾。
4.根據權利要求1所述的可長期保存的磷酸化蛋白分離電泳用預制膠，其特征在于，所述聚丙烯酰胺預制膠由上層的濃縮膠和下層的分離膠組成，所述化合物t67772和二價金屬離子添加在下層的分離膠中。
5.一種可長期保存的磷酸化蛋白分離電泳用預制膠的制備方法，其特征在于，用于權利要求1-4任一項所述的可長期保存的磷酸化蛋白分離電泳用預制膠，包括以下步驟：
6.根據權利要求5所述的可長期保存的磷酸化蛋白分離電泳用預制膠的制備方法，其特征在于，所述s1步驟中，稱取28—30克丙烯酰胺粉末和0.8—1.2克甲叉雙丙烯酰胺粉末，溶于超...
【專利技術屬性】
技術研發人員：姜自運，宋斌斌，陳煜，張佳佳，
申請(專利權)人：安徽昊拓生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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