【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及生物醫(yī)藥，尤其是nk細(xì)胞擴(kuò)增，具體涉及一種凍存后臍帶血來源的nk細(xì)胞無血清培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法。
技術(shù)介紹
1、本節(jié)中的陳述僅提供與本申請公開相關(guān)的背景信息，并且可能不構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)。
2、自然殺傷細(xì)胞(natural?killer，nk)是一類具有強(qiáng)大自然殺傷活性的先天性淋巴細(xì)胞，以非mhc限制的方式直接識別并消滅腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞，并間接改善抗體和t細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)，在清除異常和損傷細(xì)胞以及衰老細(xì)胞、殺傷病原微生物、腫瘤免疫監(jiān)測和造血重建中均發(fā)揮關(guān)鍵作用。
3、近年來免疫療法快速發(fā)展，nk細(xì)胞在腫瘤免疫細(xì)胞治療中具有巨大的潛力，對于某些血液系統(tǒng)腫瘤，如白血病、淋巴瘤等，nk細(xì)胞療法取得較好的療效。由于人體自身nk細(xì)胞的含量有限，不能從人體獲得數(shù)量大、純度高的人nk細(xì)胞，使nk細(xì)胞在免疫治療中的應(yīng)用受到了限制。開發(fā)安全且能保證nk細(xì)胞增殖效率和對腫瘤細(xì)胞殺傷效果的nk細(xì)胞培養(yǎng)體系尤為重要。采用體外擴(kuò)增的方法能夠獲得足夠數(shù)量和較高純度的人nk細(xì)胞，但不宜長時(shí)間儲存，且低溫保存后細(xì)胞毒性降低，不利于后期臨床治療。
4、目前nk細(xì)胞體外擴(kuò)增來源有外周血和臍帶血，外周血供者變異性大，獲得nk細(xì)胞總量不穩(wěn)定，而臍帶血來源的nk細(xì)胞不僅安全、便捷，而且含有更多的nk前體細(xì)胞，是更理想的nk細(xì)胞制備來源。通過對新鮮的臍帶血進(jìn)行分離純化及凍存，獲得單個核細(xì)胞，再對單個核細(xì)胞中的nk細(xì)胞選擇性誘導(dǎo)刺激擴(kuò)增，擴(kuò)展了凍存臍帶血的應(yīng)用方向。新鮮臍血制備nk細(xì)胞培養(yǎng)過程添加了自體血漿，但是臍帶血的
5、鑒于此，提出本專利技術(shù)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)的目的在于：針對目前凍存后臍帶血培養(yǎng)nk細(xì)胞血漿不足的情況，提供一種凍存后臍帶血來源的nk細(xì)胞無血清培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法，解決了現(xiàn)有技術(shù)中臍帶血單個核細(xì)胞凍存后培養(yǎng)nk細(xì)胞的自體血漿不足、操作步驟繁瑣、培養(yǎng)的nk細(xì)胞純度低等問題。
2、本專利技術(shù)的技術(shù)方案如下：
3、一種凍存后臍帶血來源的nk細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，所述nk細(xì)胞培養(yǎng)基包括包被液、誘導(dǎo)培養(yǎng)基和擴(kuò)增培養(yǎng)基；其中，
4、所述包被液包括抗cd16單克隆抗體和dpbs；
5、所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基、人源血小板裂解物和細(xì)胞因子il-15、il-18、il-21；
6、所述擴(kuò)增培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基、人源血小板裂解物和il-2。
7、根據(jù)一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述包被液中抗cd16單克隆抗體的濃度為1-5μg/ml，優(yōu)選2.2-2.8μg/ml。
8、根據(jù)一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中il-15的濃度為40-80ng/ml，優(yōu)選55-65ng/ml；所述il-18的濃度為40-80ng/ml，優(yōu)選55-65ng/ml，所述il-21的濃度為40-80ng/ml，優(yōu)選55-65ng/ml。
9、根據(jù)一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中人源血小板裂解物的用量為體積的5％-12％，優(yōu)選10％；所述擴(kuò)增培養(yǎng)基中人源血小板裂解物的用量為體積的1％-8％，優(yōu)選5％。
10、根據(jù)一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述擴(kuò)增培養(yǎng)基中il-2的濃度為500-1500iu/ml，優(yōu)選900-1100iu/ml。
11、根據(jù)一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為aim-v培養(yǎng)基。
12、本專利技術(shù)另一方面提供一種凍存后臍帶血來源的nk細(xì)胞的無血清培養(yǎng)方法，使用如前所述的一種凍存后臍帶血來源的nk細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，具體包括如下步驟：
13、步驟a、從新鮮臍帶血中提取、分離獲得單個核細(xì)胞；
14、步驟b、將分離獲得的臍帶血單個核細(xì)胞進(jìn)行凍存；
15、步驟c、將步驟b凍存后的臍帶血單個核細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇；
16、步驟d、將步驟c復(fù)蘇后的臍帶血單個核細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)、擴(kuò)增培養(yǎng)。
17、根據(jù)一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述的步驟a具體包括如下子步驟：
18、步驟a1、采集新鮮的臍帶血，采用梯度離心法進(jìn)行分離。將新鮮臍帶血放入超凈工作臺，用50ml注射器將血袋中的臍血抽取至50ml離心管中，室溫下3500r離心20min。
19、步驟a2、離心后將上層血漿吸取至新的50ml離心管中，加入適量的生理鹽水與血細(xì)胞沉淀1:1稀釋，吹打混勻，將混懸液沿離心管管壁緩慢加入到含有淋巴細(xì)胞分離液的15ml離心管中，確保分層清晰。在室溫下2500r離心20min，離心為慢升慢降。
20、步驟a3、離心結(jié)束后，吸出中間白膜層，用生理鹽水重懸混勻定容至50ml，并取樣計(jì)數(shù)。對所獲得的50ml單個核細(xì)胞懸液再進(jìn)行5倍稀釋，減少細(xì)胞離心損失；室溫下1500r離心5min，離心后棄上清，臍帶血單個核細(xì)胞制備完成。
21、根據(jù)一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述的步驟b具體包括如下子步驟：
22、步驟b1、臍帶血單個核細(xì)胞用適量的無血清細(xì)胞凍存液重懸，調(diào)整凍存的細(xì)胞密度為(1-10)×107cells/ml。進(jìn)一步地，臍帶血單個核細(xì)胞凍存密度為(2-4)×107cells/ml。
23、步驟b2、將重懸后的細(xì)胞平均分裝到凍存管內(nèi)，每支凍存管分裝約為1.5ml-4ml。將凍存管蓋子擰緊，標(biāo)注后經(jīng)程序降溫后轉(zhuǎn)移至液氮罐中長期保存。
24、根據(jù)一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述的步驟c具體包括如下子步驟：
25、步驟c1、將凍存的臍帶血單個核細(xì)胞從液氮中取出置于37℃水浴鍋中進(jìn)行復(fù)蘇；
26、步驟c2、冰晶融化后立刻將細(xì)胞取出，將解凍后的單個核細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含有適量培養(yǎng)基的無菌離心管中，加入適量的nk細(xì)胞培養(yǎng)基，輕輕混勻，取樣計(jì)數(shù)。在室溫下1500r離心5min，去除上清。進(jìn)一步地，加入nk細(xì)胞培養(yǎng)基的體積比例為1:10。
27、根據(jù)一種優(yōu)選的實(shí)施方式，所述的步驟d具體包括如下子步驟：
28、步驟d1、采用包被液提前室溫包被t75瓶30min。
29、步驟d2、將c2步驟離心后的臍帶血單個核細(xì)胞重懸于適量的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，之后接種于包被好的t75培養(yǎng)瓶中，放入37℃、5％co2培養(yǎng)箱中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，接種當(dāng)天記為第0天，誘導(dǎo)培養(yǎng)5-6天。進(jìn)一步地，nk細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基體積為20ml。
30、進(jìn)一步地，所述臍帶血單個核細(xì)胞的接種量為1-2×106cells/ml。
31、步驟d3、培養(yǎng)至第6-7天，取出t75瓶，吹打培養(yǎng)瓶，將貼在瓶底的細(xì)胞克隆團(tuán)吹散，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至50ml離心管中1500r離心5min，離心后去上清，加入200ml擴(kuò)增培養(yǎng)基，將所得沉淀細(xì)胞轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)袋中，排出多余的空氣及氣泡，放入37℃、5％co2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；
32、步驟d4、培養(yǎng)至第8-11天，向細(xì)胞培養(yǎng)袋中補(bǔ)加入800ml擴(kuò)增培本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種凍存后臍帶血來源的NK細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于，包括包被液、誘導(dǎo)培養(yǎng)基和擴(kuò)增培養(yǎng)基；其中，
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種凍存后臍帶血來源的NK細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于，所述包被液中抗CD16單克隆抗體的濃度為1-5μg/mL，優(yōu)選2.2-2.8μg/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種凍存后臍帶血來源的NK細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中所述IL-15的濃度為40-80ng/mL，優(yōu)選55-65ng/mL；所述IL-18的濃度為40-80ng/mL，優(yōu)選55-65ng/mL；所述IL-21的濃度為40-80ng/mL，優(yōu)選55-65ng/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種凍存后臍帶血來源的NK細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中人源血小板裂解物的用量為體積分?jǐn)?shù)5％-12％，優(yōu)選10％；所述擴(kuò)增培養(yǎng)基中人源血小板裂解物的用量為體積分?jǐn)?shù)1％-8％，優(yōu)選5％。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種凍存后臍帶血來源的NK細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于，所述擴(kuò)增培養(yǎng)基中IL-2的濃度為500-1500IU/mL
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種凍存后臍帶血來源的NK細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為AIM-V培養(yǎng)基。
7.一種凍存后臍帶血來源的NK細(xì)胞的無血清培養(yǎng)方法，其特征在于，使用如權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的一種凍存后臍帶血來源的NK細(xì)胞無血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，具體包括如下步驟：
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種凍存后臍帶血來源的NK細(xì)胞無血清培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的步驟D具體包括如下子步驟：
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種凍存后臍帶血來源的NK細(xì)胞無血清培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟D4中，補(bǔ)加入的擴(kuò)增培養(yǎng)基中含有或不含人源血小板裂解物。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種凍存后臍帶血來源的nk細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于，包括包被液、誘導(dǎo)培養(yǎng)基和擴(kuò)增培養(yǎng)基；其中，
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種凍存后臍帶血來源的nk細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于，所述包被液中抗cd16單克隆抗體的濃度為1-5μg/ml，優(yōu)選2.2-2.8μg/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種凍存后臍帶血來源的nk細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中所述il-15的濃度為40-80ng/ml，優(yōu)選55-65ng/ml；所述il-18的濃度為40-80ng/ml，優(yōu)選55-65ng/ml；所述il-21的濃度為40-80ng/ml，優(yōu)選55-65ng/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種凍存后臍帶血來源的nk細(xì)胞無血清培養(yǎng)基，其特征在于，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中人源血小板裂解物的用量為體積分?jǐn)?shù)5％-12％，優(yōu)選10％；所述擴(kuò)增培養(yǎng)基中人源血小板裂解物的用量為...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：董堅(jiān)，袁露，顧加明，陳艷，田翎含，蔣銘，陳娜，
申請(專利權(quán))人：昆明醫(yī)科大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：
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