【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物，尤其涉及一種原位采集自健康女性陰道的卷曲乳桿菌vb250接合轉移方法。
技術介紹
1、卷曲乳桿菌( lactobacillus?crispatus)，為革蘭氏陽性桿菌，屬于乳桿菌科、乳桿菌屬，無鞭毛，適宜生長的溫度是37℃，其營養需求復雜，能夠降解多種碳水化合物，并產生l-和d-乳酸異構體，有助于維持陰道的酸性環境，抑制有害菌的增殖。卷曲乳桿菌是一種兼性厭氧菌，但在厭氧環境中生長得更好。
2、卷曲乳桿菌在工業應用和醫學上均具有重要意義，目前利用合成生物學技術，將攜帶外源基因的載體轉移到卷曲乳桿菌內成為研究熱點。因此高效的外源基因轉移方法成為了遺傳操作的先決條件。由于乳桿菌不同種屬之間菌株的生化性質、分子構成等均存在差異，不同菌株需要采用不同的外源基因轉移方式。目前卷曲乳桿菌的外源基因轉移方法以電轉化為主，如中國專利申請cn110129249a（申請日2019.05.29）就涉及利用乳酸菌組成型表達質粒pmg36e實現了健康女性陰道中分離的乳桿菌的電轉化。由于革蘭氏陽性菌細胞壁較厚，肽聚糖含量豐富，使得基因轉移十分困難，外源dna難以穿透細胞壁進入細胞內，導致電轉化效率通常很低；其次諸如卷曲乳桿菌等對氧氣較為敏感的革蘭氏陽性菌則會因為在電轉操作時不可避免與氧氣大量時間接觸，電轉化效率可能會因為實驗條件的微小變化而波動，因此電轉化一致性和可重復性一般也比較差。
3、因此提高卷曲乳桿菌的外源基因轉移效率，對于卷曲乳桿菌的進一步應用具有重要的應
技術實現思路
1、為了解決現有技術中卷曲乳桿菌外源基因轉移效率過低的技術問題，本專利技術提供了一種卷曲乳桿菌的接合轉移方法，包括：乳桿菌培養，供體菌培養，供體菌與乳桿菌共培養，以及陽性轉化子篩選。
2、所述乳桿菌選自加氏乳桿菌、詹氏乳桿菌、卷曲乳桿菌和德氏乳桿菌中的一種，優選卷曲乳桿菌。所述卷曲乳桿菌為自然選育的菌株、經物理或化學誘變方法選育的菌株、或者基因工程方法改造的菌株；更優選為保藏編號cgmcc?no.26574的卷曲乳桿菌，于2023年02月20日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。關于該菌株的具體說明參考本申請人之前的專利申請cn202310995709.9（申請日：2023.08.09）并通過引證的方式將其并入本文。
3、所述乳桿菌培養方法為：將乳桿菌接種于mrs培養基中，30~37℃、厭氧、50～100rpm下培養至od600為0.4-1.0。
4、所述mrs培養基是指deman,?rogosa?and?sharpe培養基，具體成分包括：酵母提取物、葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、磷酸氫二鉀、檸檬酸氫二銨、乙酸鈉、硫酸鎂、硫酸錳、吐溫80；
5、根據本專利技術實施例，mrs培養基優選：酵母提取物0.5%、葡萄糖2%、蛋白胨1.0%、牛肉膏1.0%、磷酸氫二鉀0.2%、檸檬酸氫二銨0.2%、乙酸鈉0.5%、硫酸鎂0.02%、硫酸錳0.005%、吐溫80?0.1%，ph?6.2。
6、根據本專利技術實施例，所述乳桿菌培養方法為：將-80℃保存的卷曲乳桿菌在mrs無抗平板上劃線，置于厭氧箱，37℃培養2天。將單菌落轉接至mrs液體培養基中，在37℃厭氧箱中，100?rpm過夜培養種液。將種液以1%接種量轉接至50?ml?mrs液體培養基中，在37℃厭氧箱中，100?rpm培養至od600為0.4-1.0。將菌液以5000?rpm離心10?min，棄上清，菌體用3ml?mrs液體培養基重懸，備用。
7、所述供體菌為大腸桿菌( escherichia?coli)；更進一步地，所述供體菌為含外源質粒的大腸桿菌。所述的外源質粒為本領域常用的廣宿主質粒，包括但不局限于prk404、rsf1010、r388和pmg160及其衍生質粒，例如pind4、pbbr1mcs2、prksk1、prectx、ptrc99a，更優選為?pm11（seq?id?no.1）及其衍生質粒。所述的大腸桿菌為大腸桿菌( escherichia? coli)s17-1。
8、根據本專利技術實施例，所述供體菌培養和制備方法為：
9、1）感受態細胞制備：將-80℃保存的s17甘油菌置于冰上，融化后在lb無抗平板上劃線，將平板置于37℃培養箱培養過夜；挑取單菌落接種于lb液體培養基中，置于37℃搖床，220?rpm培養過夜種液；將0.1%過夜培養后的種液轉接至50?ml?lb液體培養基中，37℃，220?rpm培養2-6?h，至od600為0.4—1.0；將菌液轉移至50?ml無菌離心管中，冰上靜置10min；將離心管置于4℃預冷的離心機中，5000?rpm離心10?min；棄去上清，用10?ml預冷的0.1?m?cacl2溶液重懸細胞，冰上靜置30?min；置于4℃預冷的離心機中，5000?rpm離心10min；棄去上清，加入2?ml預冷的0.1?cacl2溶液輕柔重懸細胞，冰上分裝100?μl/支，當次使用的感受態始終置于冰上，其他感受態置于-80℃保存。
10、2）電轉化感受態細胞：將2.5?μl?pm11-gfp質粒（seq?id?no.2）加入到感受態中，輕輕吹吸混勻，轉移至預冷的電轉杯中，冰上靜置10?min；所述pm11-gfp（seq?id?no.2）為本實驗室自主構建質粒；將電轉杯電極片擦干，放入電轉儀中，設置電壓2.0?kv，電擊后加入900?μl?lb液體培養基復蘇，將液體轉移至1.5?ml?ep管中，37℃，220?rpm復蘇1?h；涂布于含有400?μg/ml紅霉素抗性的lb平板；將平板置于37℃培養箱中過夜培養。
11、所述供體菌培養方法為：將大腸桿菌接種于lb培養基中，30~37℃、100～300rpm的條件下培養至od600為0.4-1.0。
12、所述的“lb培養基”是指“luria-bertani培養基”，其基本組成為：胰蛋白胨，酵母提取物，nacl；優選：胰蛋白胨10?g/l，酵母提取物5?g/l，nacl?10?g/l，ph?7.0。
13、所述供體菌與乳桿菌共培養包含以下步驟：
14、1）將乳桿菌菌液和供體菌菌液按比例混合后接種于接合培養基中，得混合菌液；所述供體菌與乳桿菌的比例為1000:1~1:1，優選100:1~10:1；
15、2）混合菌液在接合培養基中先有氧培養，再厭氧培養。
16、根據本專利技術實施例，所述供體菌與乳桿菌共培養方法為：將混合菌液按比例混合后離心、重懸，接種于接合培養基中，在30～40℃下有氧培養0~1小時，優選0~30分鐘、而后厭氧培養得到結合菌液；所述比例為供體菌:乳桿菌=1000:1~1:1，優選供體菌:乳桿菌=100:1~10:1。
17、所述接合培養基為mr本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種卷曲乳桿菌（Lactobacillus?crispatus）VB250的接合轉移方法，包括：乳桿菌培養、供體菌培養、供體菌與乳桿菌共培養、陽性轉化子篩選，其特征在于，所述乳桿菌為卷曲乳桿菌，所述供體菌為大腸桿菌。
2.如權利要求1所述接合轉移方法，其特征在于，所述乳桿菌培養方法為：將乳桿菌接種于MRS培養基中，30~37℃、厭氧、50～100rpm下培養至OD600為0.4-1.0。
3.如權利要求2所述接合轉移方法，其特征在于，所述MRS培養基具體成分包括：酵母提取物、葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、磷酸氫二鉀、檸檬酸氫二銨、乙酸鈉、硫酸鎂、硫酸錳、吐溫80；優選成分包括：酵母提取物0.5%、葡萄糖2%、蛋白胨1.0%、牛肉膏1.0%、磷酸氫二鉀0.2%、檸檬酸氫二銨0.2%、乙酸鈉0.5%、硫酸鎂0.02%、硫酸錳0.005%、吐溫80?0.1%，pH?6.2。
4.如權利要求1所述接合轉移方法，其特征在于，所述供體菌為大腸桿菌，優選含有外源基因的大腸桿菌，所述供體菌培養方法為：將大腸桿菌接種于LB培養基中，30~37℃、100～300rp
5.如權利要求4所述接合轉移方法，其特征在于，所述LB培養基具體成分包括：胰蛋白胨，酵母提取物，NaCl；優選成分包括：胰蛋白胨10?g/L，酵母提取物5?g/L，NaCl?10?g/L，pH7.0。
6.如權利要求1所述接合轉移方法，其特征在于，所述供體菌與乳桿菌共培養包含以下步驟：
7.如權利要求6所述接合轉移方法，其特征在于，所述接合培養基為MRS培養基，成分包括：酵母提取物、葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、磷酸氫二鉀、檸檬酸氫二銨、乙酸鈉、硫酸鎂、硫酸錳、吐溫80；優選成分包括：酵母提取物0.5%、葡萄糖2%、蛋白胨1.0%、牛肉膏1.0%、磷酸氫二鉀0.2%、檸檬酸氫二銨0.2%、乙酸鈉0.5%、硫酸鎂0.02%、硫酸錳0.005%、吐溫80?0.1%，pH6.2。
8.如權利要求6所述接合轉移方法，其特征在于，所述有氧培養條件為：在30～40℃下培養0~1小時，優選0~30分鐘。
9.如權利要求6所述接合轉移方法，其特征在于，所述厭氧培養溫度為30～40℃，優選30～37℃。
10.如權利要求1所述接合轉移方法，其特征在于，所述陽性轉化子篩選將接合菌液洗脫后涂布于篩選培養基上進行篩選培養。
11.如權利要求10所述接合轉移方法，其特征在于，所述的篩選培養基為含有抗性篩選標記的MRS培養基，所述抗性篩選標記的抗生素為紅霉素和萘啶酮酸。
12.一種根據權利要求1~11任一項所述接合轉移方法制備得到的乳桿菌衍生物。
...【技術特征摘要】
1.一種卷曲乳桿菌（lactobacillus?crispatus）vb250的接合轉移方法，包括：乳桿菌培養、供體菌培養、供體菌與乳桿菌共培養、陽性轉化子篩選，其特征在于，所述乳桿菌為卷曲乳桿菌，所述供體菌為大腸桿菌。
2.如權利要求1所述接合轉移方法，其特征在于，所述乳桿菌培養方法為：將乳桿菌接種于mrs培養基中，30~37℃、厭氧、50～100rpm下培養至od600為0.4-1.0。
3.如權利要求2所述接合轉移方法，其特征在于，所述mrs培養基具體成分包括：酵母提取物、葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、磷酸氫二鉀、檸檬酸氫二銨、乙酸鈉、硫酸鎂、硫酸錳、吐溫80；優選成分包括：酵母提取物0.5%、葡萄糖2%、蛋白胨1.0%、牛肉膏1.0%、磷酸氫二鉀0.2%、檸檬酸氫二銨0.2%、乙酸鈉0.5%、硫酸鎂0.02%、硫酸錳0.005%、吐溫80?0.1%，ph?6.2。
4.如權利要求1所述接合轉移方法，其特征在于，所述供體菌為大腸桿菌，優選含有外源基因的大腸桿菌，所述供體菌培養方法為：將大腸桿菌接種于lb培養基中，30~37℃、100～300rpm的條件下培養至od600為0.4-1.0。
5.如權利要求4所述接合轉移方法，其特征在于，所述lb培養基具體成分包括：胰蛋白胨，酵母提取物，nacl；優選成分包括：胰蛋白胨10...
【專利技術屬性】
技術研發人員：梁天鑫，周潔雯，許韋，夏迷妮，傅芳田，
申請(專利權)人：杭州微致生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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