【技術實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術涉及利用鬼臼亞科植物桃兒七轉錄組文庫篩選其中主要有效成分木脂素生物合成相關cyp450基因，并利用釀酒酵母底物飼喂的方法對基因編碼蛋白進行功能活性分析，涉及到鬼臼亞科植物中參與木脂素合成的cyp450基因及其編碼產物與應用，屬于藥用植物基因工程領域。
技術介紹
1、小檗科鬼臼亞科包含桃兒七屬、山荷葉屬、北美桃兒七屬和八角蓮屬，其有效成分為木脂素、黃酮和氨基酸等。從系統(tǒng)進化的角度看，桃兒七屬為鬼臼亞科的最基部類群，該屬僅有物種桃兒七具有多種藥用功效。中藥桃兒七首載于我國現(xiàn)存最早的藏醫(yī)學古籍《月王藥診》，后因抗毒奇效收錄于《本草綱目拾遺》，是小檗科桃兒七屬植物桃兒七sinopodophyllum?hexandrum(royle)ying的根及根莖，具有祛風除濕，活血止痛，祛痰止咳之功效。作為“太白七藥”之一，桃兒七富含木脂素、氨基酸和維生素和微量元素，具有極高的營養(yǎng)價值。以芳基四氫萘類木脂素為代表活性化合物，相關化學半合成衍生物依托泊苷、替尼泊苷等為臨床廣泛應用的抗癌藥物，通過抑制微管蛋白和dna拓撲異構酶ii，發(fā)揮高效抗腫瘤作用。
2、芳基四氫萘類木脂素生物合成途徑可分為4部分：(1)高度保守的上游苯丙烷途徑生成松柏醇(coniferyl?alcohol,ca)；(2)松柏醇到去氧鬼臼毒素(deoxypodophyllotoxin,dpt)；(3)去氧鬼臼毒素羥基化和甲基化修飾；(4)糖基化修飾生成水溶性更強的糖苷化合物。其中細胞色素p450(cytochromep450,cyp450)酶在修飾過程發(fā)揮著重要
技術實現(xiàn)思路
1、本專利技術的目的在于提供一個鬼臼亞科植物桃兒七中的參與木脂素生物合成途徑的cyp450基因shcyp736a469，其編碼的蛋白能夠在合適cyp450還原酶(cytochromep450reductase,cpr)的協(xié)同下催化(-)-去氧鬼臼毒素c-4位α-羥基化，生成(-)-鬼臼毒素。
2、本專利技術提供一個芳基四氫萘類木脂素生物合成途徑關鍵基因：shcyp736a469，它的核苷酸序列如序列表中的seq?id?no.1所示。以及一種由上述基因編碼的蛋白質，具有序列表中的seq?id?no.2氨基酸序列編碼的蛋白質，具有序列表中seq?id?no.2的氨基酸殘基序列以及具有seq?id?no.2的氨基酸殘基序列相同活性的由seq?id?no.2衍生的蛋白質。
3、本專利技術seq?id?no.1的dna序列由1503個堿基組成，編碼序列表中由500個氨基酸殘基組成的蛋白質序列seq?id?no.2。
4、二代轉錄組數(shù)據(jù)表明，本專利技術克隆的基因shcyp736a469在鬼臼亞科植物桃兒七根和莖中的表達量均呈較高水平，其中在積累木脂素的根中表達明顯高于莖等地上部分；并且根和莖中的表達量均隨茉莉酸的誘導發(fā)生上調。
5、含有本專利技術基因shcyp736a469的篩選方法、表達載體、細胞系及宿主菌和使用該基因在后續(xù)芳基四氫萘類木脂素結構修飾酶的理性設計和定向改造，生物合成途徑元件的開發(fā)利用以及芳基四氫萘類木脂素的合成生物學異源高效生產也在本專利技術的保護范圍之內。選用pesc-leu為shcyp736a469基因釀酒酵母by4741真核表達載體，在限制性內切酶bamhi和sal?i位點間插入雷公藤tripterygium?wilfordii?hook.f.來源的cyp450還原酶twcpr3，并將seq?id?no.1基因克隆到真核表達載體pesc-leu的限制性內切酶not?i和spei位點間，構建帶有shcyp736a469基因的重組表達質粒pesc-leu::(shcyp736a469+twcpr3)；轉入酵母菌株by4741表達宿主菌采用半乳糖誘導表達。以(-)-去氧鬼臼毒素作為底物進行飼喂驗證功能，乙酸乙酯萃取反應產物，lc-ms分析產物與標準品對比保留時間及質譜裂解規(guī)律。lc-ms分析結果表明，(-)-去氧鬼臼毒素在shcyp736a469酶的催化下，生成了[m+h]+＝415.13794的正離子峰，通過分析產物的分子離子峰以及與同液相條件下鬼臼毒素標準品化合物峰對比，認為該產物為(-)-鬼臼毒素。研究結果表明，本專利技術與芳基四氫萘類木脂素鬼臼毒素合成有關的基因具有細胞色素p450基因的特征結構域，底物飼喂實驗結果表明該基因能催化(-)-去氧鬼臼毒素c-4位α-羥基化形成(-)-鬼臼毒素，對后續(xù)鬼臼毒素后續(xù)芳基四氫萘類木質素結構修飾酶的理性設計和定向改造以及生物合成途徑元件的開發(fā)利用具有重要的理論及實際意義。
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1.分離的酶，所述酶具有如SEQ?ID?NO：2所示的氨基酸序列。
2.編碼權利要求1所述酶的多核苷酸。
3.權利要求2所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸具有如SEQ?ID?NO：1所示的核酸序列。
4.包含權利要求2或3所述多核苷酸的表達載體。
5.包含權利要求2或3所述多核苷酸、或權利要求4所述表達載體的重組宿主菌。
6.權利要求5所述的重組宿主菌，所述宿主菌為釀酒酵母。
7.權利要求1所述酶、或權利要求2或3所述多核苷酸、或權利要求4所述表達載體、或權利要求5或6所述重組宿主菌在調節(jié)和/或合成鬼臼毒素類化合物中的應用。
8.權利要求7所述的應用，其中芳基四氫萘類木脂素化合物為(-)-鬼臼毒素及其衍生物。
9.包含權利要求1所述酶的組合物。
10.包含權利要求1所述的氨基酸序列相似度高于90％的多氨基酸序列及其編碼的酶。
【技術特征摘要】
1.分離的酶，所述酶具有如seq?id?no：2所示的氨基酸序列。
2.編碼權利要求1所述酶的多核苷酸。
3.權利要求2所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸具有如seq?id?no：1所示的核酸序列。
4.包含權利要求2或3所述多核苷酸的表達載體。
5.包含權利要求2或3所述多核苷酸、或權利要求4所述表達載體的重組宿主菌。
6.權利要求5所述的重組宿主菌，所述宿...
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：胡雅婷，黃璐琦，沈思雨，童宇茹，
申請(專利權)人：首都醫(yī)科大學，
類型：發(fā)明
國別省市：
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