【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物醫藥領域，具體是一種實現sirna和3bp的共遞送的新型納米藥物及其制備方法和應用。
技術介紹
1、kras基因是mapk通路中最常見的突變，占所有人類癌癥的30％。在高達52％的癌癥(crc)病例中，臨床實踐中常規對kras突變進行檢測。這些突變與對化療的敏感性低和對靶向egfr抑制劑(西妥昔單抗)的治療的耐藥性有關，通常會預后不良。此外，野生型kras患者在抗egfr治療期間，可能會出現隨后的突變，從而對egfr抑制劑產生耐藥性，導致治療失敗。目前沒有藥物能有效治療kras突變。
2、腫瘤維持增殖信號的能力取決于kras等驅動癌基因的持續激活。小干擾rna(sirna)可以識別特定的信使rna(mrna)序列進行沉默，是治療耐藥腫瘤和難治性突變癌基因的潛在治療方式。針對突變特異性kras?sirna或廣譜kras?sirna已被證明可以特異性抑制依賴kras突變生存的腫瘤，相關毒性最小。然而，裸sirna在體內容易被核酸酶降解，并有引發脫靶效應的風險。因此，對基于sirna的先進療法的探索仍在繼續，重點是提高穩定性和靶向療效。
3、癌基因的活性與異常的腫瘤代謝和腫瘤微環境改變密切相關。值得注意的是，即使在有氧條件下，腫瘤細胞也更傾向于糖酵解而非氧化磷酸化作為能量供應的代謝方式，這種異?，F象被稱為“warburg?effect”。糖酵解過程中產生的大量中間代謝產物為癌癥細胞的劇烈增殖提供了原料。因此，靶向糖酵解已成為癌癥治療的一種創新方法。致癌的kras基因已被證明可以通過上調葡萄糖轉
4、外泌體(exo)是直徑為30～200nm的納米級脂質雙層膜囊泡，幾乎所有細胞類型都會分泌。它們含有許多蛋白質、編碼和非編碼rna在細胞間通訊和運輸中起重要作用的脂質。作為載體，外泌體具有低免疫原性、生物相容性、無毒性、強載物能力和貨物保護等特點。使用外泌體作為運輸sirna的載體可以保護sirna的穩定性，并為同時攜帶3bp提供足夠的空間。然而，同源靶向腫瘤的腫瘤衍生外泌體可能不是最佳選擇。越來越多的證據表明，核酸(rna/dna)和蛋白質可以促進腫瘤的發展和轉移。選擇性膜修飾可以克服天然外泌體靶向能力低的缺點。egfr是驅動細胞增殖、分化和存活的關鍵因素之一，在大多數結直腸癌中過表達，是使用egfr抑制劑作為靶向修飾的(西妥昔單抗，ctx)的理論基礎。ctx可以被修飾為外泌體膜上的靶向抗體，抗體介導的內吞作用用于卸載藥物以獲得治療效果。
技術實現思路
1、為了解決現有技術的不足，本專利技術的目的在于提供一種新型納米藥物及其制備方法和應用。
2、為了解決上述問題，本專利技術所采用的技術方案如下：
3、一種新型納米藥物的其制備方法，包括以下步驟：
4、(1)收集、分離純化外泌體；
5、(2)將sirna和3bp通過電穿孔的方法裝載到外泌體內：將sirna、3bp和外泌體混合到400μl電穿孔緩沖液中，并在bio-rad?gene電穿孔裝置上實施，0.4cm比色皿中在工作電壓400m?v，電容(脈沖時間10～15ms)125μf進行電穿孔；
6、(3)電穿孔后用rnase處理外泌體，去除任何可能與外泌體膜結合的sirna，然后用預冷pbs稀釋外泌體，100,000g離心70min，去除未結合的sirna和3bp。
7、在某些實施例中，還包括將西妥昔單抗輟和在外泌體表面的步驟：ctx和dspe-peg-nhs以質量比為4：1的比例混合在mes緩沖液(ph＝8)中，室溫80rpm攪拌4小時反應連接，將dspe-peg-ctx溶于dmso中，然后與步驟(3)制備得到的外泌體，以dspe-peg-ctx：外泌體重量比為1：1混合，在37℃孵育2小時后，在300k?nanosep離心裝置中超濾除去游離的dspe-peg-ctx和ctx。
8、在某些實施例中，所述外泌體通過培養hek293t細胞，然后收集細胞上清液體進行多步梯度離心、重懸獲得。
9、在某些實施例中，所述多步梯度離心包括以下步驟：(1)1000g?10min離心去除死細胞，收集上清；
10、(2)2000g?20min離心去除細胞碎片；
11、(3)10000g?30min離心去除大囊泡和小細胞碎片，收集上清棄沉淀；
12、(4)100000g?70min離心，沉淀為外泌體。
13、在某些實施例中，穿孔前，所述外泌體:sirna的重量比8～11：1，外泌體:3bp的重量比1：5～6。
14、在某些實施例中，所述外泌體:sirna的重量比為10：1，外泌體:3bp的重量比為1：4。
15、在某些實施例中，電穿孔混合物中外泌體的最終濃度不超過0.5μg/μl。
16、在某些實施例中，將電穿孔前的試劑和耗材進行depc處理，降低rna的降解。
17、本專利技術還提供一種新型納米藥物，由上述方法制備得到。
18、在某些實施例中，所述藥物可用于制備生物相容性高的抗腫瘤藥物。
19、本專利技術設計并合成了exo@sirna/3bp-ctx工程外泌體(erbc)，其選擇性靶向過表達egfr的腫瘤組織。采用的外泌體sirna遞送平臺有效地減輕了與未修飾sirna相關的不穩定性和非特異性靶向性，從而確保了穩定的基因沉默功效。并在kras-突變大腸癌癌癥模型中，在癌基因沉默后重新建立ctx的治療敏感性。這種基因沉默方式不僅降低突變癌癥細胞的增殖和生存能力，而且抑制glut1基因的過度表達。從而減弱細胞葡萄糖攝取。此外，增強3bp通過直接能量抑制協同增強饑餓療法。它還延長了動物模型小鼠的存活時間，這歸因于增強了靶向能力以減少治療副作用。
20、相比現有技術，本專利技術的有益效果在于：
21、1，這一符合納米藥物同時包含基因治療和饑餓治療的兩種作用；
22、2，并對kras突變的腫瘤有特異性的靶向性，在正常組織的聚集遠遠小于腫瘤組織，瘤外副作用小。
23、3，在外泌體的包裹下，在生物體的相容性高于無機納米材料；
24、4，對比無機納米材料，外泌體修飾下的材料，可以在生物體內完全分解，無蓄積毒性可能。
25、5，藥物穩定性強，在不同緩沖液中存放48小時本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種新型納米藥物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述一種新型納米藥物的其制備方法，其特征在于：還包括將西妥昔單抗輟和在外泌體表面的步驟，CTX和DSPE-PEG-NHS的質量比為4：1的比例混合在MES緩沖液(PH＝8)中，室溫80rpm攪拌4小時反應連接，將DSPE-PEG-CTX溶于DMSO中，然后與步驟(3)制備得到的外泌體，以DSPE-PEG-CTX：外泌體重量比為1：1混合，在37℃孵育2小時后，在300K?Nanosep離心裝置中超濾除去游離的DSPE-PEG-CTX和CTX。
3.根據權利要求1所述一種新型納米藥物的其制備方法，其特征在于：所述外泌體通過培養HEK293T細胞，然后進行多步梯度離心、重懸獲得。
4.根據權利要求1所述一種新型納米藥物的其制備方法，其特征在于：所述多步梯度離心包括以下步驟：
5.根據權利要求1所述一種新型納米藥物的其制備方法，其特征在于：穿孔前，所述外泌體:siRNA的重量比8～11：1，外泌體:3BP的重量比1：5～6。
6.根據權利要求5所述一
7.根據權利要求1-6任一項所述一種新型納米藥物的其制備方法，其特征在于：電穿孔混合物中外泌體的最終濃度不超過0.5μg/μL。
8.根據權利要求7所述一種新型納米藥物的其制備方法，其特征在于：將電穿孔前的試劑和耗材進行DEPC處理，降低RNA的降解。
9.一種新型納米藥物，其特征在于：由權利要求1-8任一項所述的方法制備得到。
10.權利要求9所述藥物在制備生物相容性高的抗腫瘤藥物中的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種新型納米藥物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述一種新型納米藥物的其制備方法，其特征在于：還包括將西妥昔單抗輟和在外泌體表面的步驟，ctx和dspe-peg-nhs的質量比為4：1的比例混合在mes緩沖液(ph＝8)中，室溫80rpm攪拌4小時反應連接，將dspe-peg-ctx溶于dmso中，然后與步驟(3)制備得到的外泌體，以dspe-peg-ctx：外泌體重量比為1：1混合，在37℃孵育2小時后，在300k?nanosep離心裝置中超濾除去游離的dspe-peg-ctx和ctx。
3.根據權利要求1所述一種新型納米藥物的其制備方法，其特征在于：所述外泌體通過培養hek293t細胞，然后進行多步梯度離心、重懸獲得。
4.根據權利要求1所述一種新型納米藥物的其制備方法，其特征在于：所述多步梯度離心...
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