【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于基因工程，具體涉及一種編碼具有生物學(xué)活性的綠色熒光標(biāo)記的神經(jīng)生長因子融合蛋白的融合基因的構(gòu)建和應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、神經(jīng)生長因子蛋白ngf是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中的第一個被鑒定的成員。ngf是一個130-140kda分子量的蛋白，由α,β和γ三個亞單位組成，ngf的生物學(xué)活性主要來自于β亞單位，它是由兩個單體組成的27kda的二聚體。ngf是維持神經(jīng)細胞發(fā)育和生存所必需的，它可以調(diào)節(jié)細胞的大小、促進神經(jīng)細胞突起的發(fā)生和軸突的延長。雖然成熟的神經(jīng)細胞在短時間內(nèi)可以耐受ngf的缺失，但是，細胞會發(fā)生萎縮等病理性改變，并發(fā)生漸進性死亡。在體內(nèi)，雖然膠質(zhì)細胞含有ngf，但是，內(nèi)源性的ngf主要來自神經(jīng)細胞。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)(pns)損傷后，內(nèi)源性的ngf和ngf受體的表達量是增加的。而給予外源性的ngf能夠促進受損的神經(jīng)細胞的生存、軸突的延長和功能的修復(fù)。例如，腦損傷后，給予外源性的ngf能夠阻止膽堿能神經(jīng)細胞的凋亡和壞死。對外周神經(jīng)離斷的研究發(fā)現(xiàn)，外源性的ngf可以增加軸突再生的數(shù)量和髓鞘的形成。在脊髓背根損傷的部位，給予包括ngf在內(nèi)的神經(jīng)營養(yǎng)因子可以促進受損的軸突生長入脊髓。由此可見，給予外源性的ngf有助于受損神經(jīng)的修復(fù)和再生。
2、但是，在給予外源性的ngf蛋白/ngf基因治療cns疾病時，現(xiàn)有的檢測和示蹤ngf的技術(shù)和方法存在諸多明顯的缺點，如：1)在通過化學(xué)、放射性同位素和熒光的方法來標(biāo)記ngf蛋白時，很難進行計量控制，重復(fù)性很差，有時獲得的結(jié)果互相矛盾，且放射性同位素對身體有害
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、針對現(xiàn)有技術(shù)的不足和實際需求，本專利技術(shù)設(shè)計和構(gòu)建了一種編碼具有生物學(xué)活性的綠色熒光標(biāo)記的ngf融合蛋白的融合基因，該融合基因可以在細胞和組織內(nèi)表達成帶有綠色熒光的ngf融合蛋白，從而可以直接在熒光顯微鏡下觀測其在細胞和組織內(nèi)的表達和分布，且該融合蛋白中仍然具有ngf蛋白的生物學(xué)活性，可以通過測定該融合蛋白的熒光強度或融合蛋白的含量，對該融合蛋白中ngf蛋白進行準確的計量。
2、本專利技術(shù)提供了一種編碼具有生物學(xué)活性的綠色熒光標(biāo)記的ngf融合蛋白的融合基因，其特征在于，其由ngf基因、特有的45個核苷酸序列、kozak序列、綠色熒光蛋白基因ng融合形成，其核苷酸序列如seq?id?no.1所示。
3、本專利技術(shù)還提供了一種具有生物學(xué)活性的綠色熒光標(biāo)記的ngf融合蛋白，其氨基酸序列如seq?id?no.2所示。
4、本專利技術(shù)還提供了一種表達質(zhì)粒，該表達質(zhì)粒攜帶上述的核苷酸序列如seq?idno.1所示的融合基因，該表達質(zhì)粒所攜帶的基因表達元件能夠介導(dǎo)所述的融合基因在細胞內(nèi)的表達。
5、本專利技術(shù)還提供了一種病毒載體，其攜帶上述的核苷酸序列如seq?id?no.1所示的融合基因，該病毒載體能夠使上述的融合基因進入體外培養(yǎng)的細胞進行表達，并且能夠使該融合基因通過動物體內(nèi)的血腦屏障，在動物的腦組織內(nèi)進行表達。
6、進一步的，所述的病毒載體是利用上述的表達質(zhì)粒與另外兩個質(zhì)粒phelper和pcap-b10按照1:1:1的比例轉(zhuǎn)入21x150cm2的293t細胞，在含有體積百分比濃度為10％胎牛血清的dmem中進行培養(yǎng)，從而包裝制備得到的。
7、本專利技術(shù)還提供了一種上述的核苷酸序列如seq?id?no.1所示融合基因、或含有上述的融合基因的表達質(zhì)粒的構(gòu)建方法，含有如下步驟：
8、步驟一、使用rna提取試劑盒提取小鼠大腦的總rna，通過nano?drop測定樣品中的rna含量，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測rna的存在、完整性和純度；
9、步驟二、通過rt-pcr將mrna逆轉(zhuǎn)錄成cdna，以cdna為模板，通過下列引物，進行pcr，合成含45個核苷酸及kozak序列的β-ngf基因：
10、forward引物：gcggcccaacggtaccatgtccatgttgttctacactctga，
11、reverse引物：
12、ccatggtggcggtaccggatcctcctcctccggatcctcctcctccggatcctcctcctccgcctcttct?tgtagccttcctg，
13、步驟三、用限制性內(nèi)切酶acc65i酶切攜帶有綠色熒光蛋白基因ng的表達質(zhì)粒pcag-ng，通過凝膠回收試劑盒回收質(zhì)粒；將步驟二合成的含45個核苷酸及kozak序列的β-ngf基因連接到pcag-ng上，構(gòu)建得到含ngf基因、特有的45個核苷酸序列、kozak序列、綠色熒光蛋白基因ng組成的融合基因的表達質(zhì)粒即pcag-ngf-ng表達質(zhì)粒。
14、本專利技術(shù)還公開了上述的融合基因或上述的融合蛋白或上述的表達質(zhì)粒或上述的病毒載體在制備治療神經(jīng)損傷的修復(fù)和再生的藥物中的應(yīng)用。
15、進一步的，所述的神經(jīng)損傷為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷和/或周圍神經(jīng)系統(tǒng)損傷。
16、本專利技術(shù)還公開了上述的融合基因或上述的的融合蛋白在檢測治療神經(jīng)損傷的修復(fù)和再生的藥物效果中的應(yīng)用。
17、進一步的，所述的應(yīng)用中可以通過檢測神經(jīng)生長因子(ngf蛋白)的存在及其含量來評估治療效果。
18、本專利技術(shù)和已有技術(shù)相比，其技術(shù)效果是積極和明顯的。將本專利技術(shù)的融合基因通過表達質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)染入細胞后，或者將其包裝成aav病毒載體，再轉(zhuǎn)導(dǎo)入體外培養(yǎng)的細胞后，或者將其包裝成aav病毒載體，靜脈注射給小鼠后，該ngf基因-綠色熒光蛋白基因形成的融合基因可以在細胞和組織內(nèi)，表達成帶有綠色熒光的ngf蛋白。通過熒光顯微鏡，即可以直接觀測其在細胞和組織內(nèi)的表達和分布，而不需要再進行額外的免疫組織化學(xué)/免疫熒光染色。通過測定ngf融合蛋白的熒光強度或含量，能夠?qū)υ撊诤系鞍字衝gf蛋白含量進行計量。此外，該融合基因表達出的帶有綠色熒光的ngf融合蛋白仍然具有ngf蛋白的生物學(xué)活性，能夠促進類神經(jīng)細胞軸突的生長，促進顱腦創(chuàng)傷后小鼠的運動和海馬空間記憶功能的恢復(fù)。
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1.一種編碼具有生物學(xué)活性的綠色熒光標(biāo)記的神經(jīng)生長因子融合蛋白的融合基因，其特征在于，其由神經(jīng)生長因子基因Ngf、特有的45個核苷酸序列、Kozak序列、綠色熒光蛋白基因Ng融合形成，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。
2.一種具有生物學(xué)活性的綠色熒光標(biāo)記的神經(jīng)生長因子融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示。
3.一種表達質(zhì)粒，其特征在于，其攜帶權(quán)利要求1所述的融合基因。
4.一種病毒載體，其特征在于，其攜帶權(quán)利要求1所述的融合基因。
5.權(quán)利要求1所述的具有生物學(xué)活性的綠色熒光標(biāo)記的神經(jīng)生長因子融合蛋白的融合基因或權(quán)利要求3所述的表達質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于，含有如下步驟：
6.權(quán)利要求4所述的病毒載體的構(gòu)建方法，其特征在于，其是將權(quán)利要求5構(gòu)建得到的表達質(zhì)粒與質(zhì)粒pHelper、pCAP-B10按照1:1:1的比例轉(zhuǎn)入21x150cm2的293T細胞，在含有體積百分比濃度為10％胎牛血清的DMEM中進行培養(yǎng)，從而包裝制備得到。
7.權(quán)利要求1所述的融合基因或權(quán)利要求2所述的融合蛋白或
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的神經(jīng)損傷為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷和/或周圍神經(jīng)系統(tǒng)損傷。
9.權(quán)利要求1所述的融合基因或權(quán)利要求2所述的融合蛋白在檢測治療神經(jīng)損傷的修復(fù)和再生的藥物效果中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，通過檢測神經(jīng)生長因子的存在及其含量來評估治療效果。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種編碼具有生物學(xué)活性的綠色熒光標(biāo)記的神經(jīng)生長因子融合蛋白的融合基因，其特征在于，其由神經(jīng)生長因子基因ngf、特有的45個核苷酸序列、kozak序列、綠色熒光蛋白基因ng融合形成，其核苷酸序列如seq?id?no.1所示。
2.一種具有生物學(xué)活性的綠色熒光標(biāo)記的神經(jīng)生長因子融合蛋白，其氨基酸序列如seq?id?no.2所示。
3.一種表達質(zhì)粒，其特征在于，其攜帶權(quán)利要求1所述的融合基因。
4.一種病毒載體，其特征在于，其攜帶權(quán)利要求1所述的融合基因。
5.權(quán)利要求1所述的具有生物學(xué)活性的綠色熒光標(biāo)記的神經(jīng)生長因子融合蛋白的融合基因或權(quán)利要求3所述的表達質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于，含有如下步驟：
6.權(quán)利要求4所述的病毒載體的構(gòu)建方法，其特征在...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：林勇，王江暢，馮軍峰，黃佳琳，翁維吉，高穎蔚，
申請(專利權(quán))人：上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院，
類型：發(fā)明
國別省市：
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