【技術實現步驟摘要】
本申請涉及生物工程，具體而言，涉及一種非診斷目的恒溫條件下改進合成核酸的方法及試劑盒和應用。
技術介紹
1、作為擴增靶基因的方法，lamp技術(nucleicacids?res,2000,28(12):e63.)的核心是利用針對靶基因上的六個區域設計四條特異性引物依靠一種高活性鏈置換dna聚合酶，使得鏈置換dna合成在不停地自我循環。該技術可在15-60分鐘內實現109-1010倍的擴增，反應能產生大量的擴增產物即焦磷酸鎂白色沉淀，可以通過肉眼觀察白色沉淀的有無來判斷靶基因是否存在，日本榮研公司亦針對性開發出濁度儀以實現擴增反應實時監測。lamp方法的優勢除了高特異性和高靈敏度外，操作還十分的簡單，在應用階段對儀器的要求低，一個簡單的恒溫裝置就能實現反應，結果檢測也非常簡單，直接肉眼觀察白色沉淀或者綠色熒光即可，是一種適合現場、基層快速檢測的方法。其中一個局限是，因該方法高特異性和靈敏度等特點依賴于4條引物的性質，最佳引物的獲得通常需要進行序列比對、在線引物設計、引物篩選及特異性試驗，這一過程十分繁瑣(j?chromatogra,2015,1377:13-26.)。
技術實現思路
1、本專利技術的目的是提供一種優化lamp、camp和cda等方法合成核酸的引物設計的方法，本專利技術的優勢之一在于僅利用一對常規pcr引物進行重組后的僅一對新引物即可實現對于核酸的擴增。本專利技術的優勢之二是所用核心引物的長度約為30bp，較lamp原用的約為40bp的核心引物縮短了10-15bp，這即
2、本專利技術人改進了已知方法3’-oh的供給，結果發現通過利用具有特定結構的寡核苷酸，不需任何額外酶反應3’-oh結構就可被提供，由此得出本專利技術。即本專利技術涉及合成核酸的方法，通過用所述核酸合成方法擴增核酸的方法和應用所述方法合成核酸的試劑盒。
3、為解決上述技術問題，本申請采用的技術方案：
4、本專利技術獲得的核酸鏈能夠自主配對無限延伸，該核酸鏈上3’端的f1區與臨近的f1c區退火，引發核酸鏈不斷的延伸反應。
5、作為優選實施方案，具體合成核酸的步驟圖解如圖1所示，包括以下步驟：
6、1)提供一種核酸的步驟，3’末端具有可與同一條鏈上的f區的f2c退火的f2區，同時該核酸的5’末端具有可與同一條鏈上的r區的r2退火的r2c區，該核酸可自發形成短鏈互補頸環結構；
7、2)使第一寡核苷酸i與步驟1)提供的所述核酸的f1c區退火，然后以所述第一寡核苷酸i的f1區作為合成起點，進行合成步驟；其中所述第一寡核苷酸i包括f2c區與fl區；
8、3)以步驟1)提供的所述核酸為模板合成其自身的互補鏈，將合成完后的核酸序列稱為第一核酸；
9、4)使第二寡核苷酸ii與步驟3)提供的所述第一核酸的r1c區退火，然后以所述第二寡核苷酸ii的r1區作為合成起點，進行合成步驟；其中所述第二寡核苷酸ii包括r2c區和r1區；
10、5)以步驟3)提供的所述第一核酸為模板合成其自身的互補鏈，并且該核酸鏈上具有交替連接的互補核苷酸序列區。
11、其中，步驟1)中核酸的制備方法包括以下步驟：
12、1-a)退火步驟，使第一核苷酸的f1區與模板的f1c區退火，其中所述模板3’至5’方向依次由fc區和r區組成；所述fc區包括f1c和f2c區，r區包括r1區和r2區，f區包括f1區和f2區；所述第一核苷酸從5’端到3’端依次為f2c區、f1區；
13、1-b)以所述第一寡核苷酸的f2區作為合成起點，合成第一核酸其中，所述第二寡核苷酸從5’端到3’端依次為r2c區、r1區；所述第一核酸具有與所述模板互補的核苷酸序列，所述第一核酸的5’末端具有可與同一條鏈上的f2區退火的f2c區；
14、1-c)在恒溫條件下，使第二寡核苷酸的r1區與所述第一核酸的r1c區退火，其中，所述第二寡核苷酸從5’端到3’端依次為r2c區、r1區；所述r區包括r1區和r2區，rc區包括r1c區和r2c區；
15、1-d)以所述第二寡核苷酸的r1區作為合成起點，合成第二核酸，即獲得所述步驟1)中提供的核酸；
16、其中，f區：具有與fc區互補的核苷酸序列的區；
17、f1區：具有與f1c區互補的核苷酸序列的區；
18、f2區：具有與f2c區互補的核苷酸序列的區；
19、r區：具有與rc區互補的核苷酸序列的區；
20、r1區：具有與r1c區互補的核苷酸序列的區；
21、r2區：具有與r2c區互補的核苷酸序列的區。
22、參見圖2，為本專利技術中上述步驟1)中一種核酸的合成方法所對應的合成步驟圖解，即圖2中的第二核酸，從5’至3’方向依次由r2c、r1、r2、f2c、f1c、f2區組成。
23、作為優選實施方案，所述步驟1-a)中的模板為rna，步驟1-b)中的第一核酸通過具有反轉錄酶活性的酶來合成。
24、優選地，所述步驟1-1)所述模板為rna，步驟1-2)中的第一核酸通過具有反轉錄酶活性的酶來合成。本專利技術適用于各種dna及rna，例如各種動植物細胞、細菌和病毒的dna及rna等等。比如，用于h1n1病毒的h1基因和n1基因的cdna及rna檢測等。
25、優選地，所述f1區、和r1區的核酸片段均為10-30bp。進一步優選地，所述f1區和r1區的核酸片段均為15-25bp。
26、優選地，所述f區和r區的核酸片段均為20-50bp。進一步優選地，所述f區和r區的核酸片段均為20-40bp。
27、根據本專利技術所述的合成核酸的方法，其中，所述合成的核酸是指在其一條鏈上具有首尾區段分別與中間區段的不同部分互補配對核苷酸序列的核酸，以該核酸為基礎在第一寡核苷酸和第二寡核苷酸和作用下繼續進行核酸合成的過程，參見圖3和圖4。
28、根據本專利技術所述的合成核酸的方法，其中，所述恒溫是指整個反應過程在60-65℃的溫度范圍內進行合成。
29、本專利技術所述聚合酶催化鏈置換反應中使用的聚合酶為bst?dna聚合酶、bca(exo-)dna聚合酶、dna聚合酶i克列諾(klenow)片段、vent?dna聚合酶、vent(exo-)dna聚合酶(缺少核酸外切酶活性的vent?dna聚合酶)、deep?vent?dna聚合酶、deep?vent(exo-)dna聚合酶(缺少核酸外切酶活性的deep?vent?dna聚合酶)、φ29phage?dna聚合酶以及ms-2phagedna聚合酶等中的一種或幾種。其中優選使用bst?dna聚合酶或bst?2.0dna聚合酶。
30、根據本專利技術所述的合成核酸的方法，其中，所述聚合酶催本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種非診斷目的恒溫條件下改進合成核酸的方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的一種非診斷目的恒溫條件下改進合成核酸的方法，其特征在于，具體包括以下步驟：
3.根據權利要求2所述的一種非診斷目的恒溫條件下改進合成核酸的方法，其特征在于，所述步驟1)中核酸的制備方法包括以下步驟：
4.根據權利要求3所述的一種非診斷目的恒溫條件下改進合成核酸的方法，其特征在于，步驟1-a)所述模板為RNA，步驟1-b)中的第一核酸通過具有反轉錄酶活性的酶來合成。
5.根據權利要求2-4任一項所述的一種非診斷目的恒溫條件下改進合成核酸的方法，其特征在于，所述F1區、F2區、R1區和R2區的核酸片段均為10-30bp。
6.根據權利要求1或2所述的一種非診斷目的恒溫條件下改進合成核酸的方法，其特征在于，獲得的所述核酸鏈能夠自主配對無限延伸，所述合成的核酸是指在其一條鏈上具有首尾區段分別與中間區段的不同部分互補配對核苷酸序列的核酸；提供合適的條件，該核酸鏈可通過堿基互補配對形成較短的頸環鏈；該核酸鏈上3’端的F2區會與該鏈上的
7.一種合成核酸的試劑盒，其特征在于，所述核酸在其一條鏈上具有首尾互補核苷酸序列，并且該核酸鏈上具有交替連接的互補核苷酸序列；所述試劑盒包括以下組分：
8.一種如權利要求7所述的試劑盒在合成核酸或檢測樣品中靶核苷酸序列中非診斷目的的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種非診斷目的恒溫條件下改進合成核酸的方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的一種非診斷目的恒溫條件下改進合成核酸的方法，其特征在于，具體包括以下步驟：
3.根據權利要求2所述的一種非診斷目的恒溫條件下改進合成核酸的方法，其特征在于，所述步驟1)中核酸的制備方法包括以下步驟：
4.根據權利要求3所述的一種非診斷目的恒溫條件下改進合成核酸的方法，其特征在于，步驟1-a)所述模板為rna，步驟1-b)中的第一核酸通過具有反轉錄酶活性的酶來合成。
5.根據權利要求2-4任一項所述的一種非診斷目的恒溫條件下改進合成核酸的方法，其特征在于，所述f1區、f2區、r1區和r2區的核酸片段均為10-3...
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