【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于生物，具體涉及一種分泌中和活性的產(chǎn)氣莢膜梭菌etx單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、產(chǎn)氣莢膜梭菌（ clostridium?perfringens，cp）最初于1892年從腐敗的尸體中分離得到，命名為魏氏梭菌。cp能夠廣泛存在于植物、土壤、河流等自然環(huán)境、處理不徹底的動物制品以及人類和動物胃腸道，是一種能夠通過多種途徑在人類、動物和自然環(huán)境間傳播的人畜共患致病菌（derongs?l,?druilhe?c,?ziebal?c,?et?al.?characterization?ofclostridium?perfringens?isolates?collected?from?three?agricultural?biogasplants?over?a?one-year?period[j].?int?j?environ?res?public?health.?2020?jul29;17(15):5450.）。通常情況下，這些菌株并不會引起動物發(fā)病。但當(dāng)腸道內(nèi)環(huán)境遭到破壞或外界環(huán)境劇烈變化時(shí)，產(chǎn)氣莢膜梭菌在腸道內(nèi)大量增殖，并同時(shí)產(chǎn)生多種毒素，從而導(dǎo)致動物發(fā)病（navarro?ma,?mcclane?ba,?uzal?fa.?mechanisms?of?action?and?cell?deathassociated?with?clostridium?perfringens?toxins[j].?toxins?(basel).?2018?may22;10(5):212.）。根據(jù)產(chǎn)氣莢膜梭
2、?毒素（etx）由b型和d型c.?perfringens?菌株產(chǎn)生，是由位于pcw3樣質(zhì)粒上的毒素基因etx編碼、296位氨基酸組成、分子量大小為33?kda的穿孔毒素（miyata?s,matsushita?o,?minami?j,et?al.cleavage?of?a?c-terminal?peptide?is?essentialfor?heptamerization?of?clostridium?perfringens?epsilon-toxin?in?thesynaptosomal?membrane[j].?j?biol?chem.?2001?apr?27;276(17):13778-83.）。etx是d型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起機(jī)體發(fā)病的關(guān)鍵毒素，該毒素剛產(chǎn)生時(shí)毒力較弱，可通過腸道中多種蛋白酶加工去除n端和c端殘基或菌體自身產(chǎn)生λ蛋白酶切割n端第10位和11位氨基酸連接的方式進(jìn)行激活（freedman?jc,?li?j,?uzal?fa,et?al.proteolytic?processing?andactivation?of?clostridium?perfringens?epsilon?toxin?by?caprine?smallintestinal?contents[j].?mbio.?2014?oct?21;5(5):e01994-14.）。活化后的etx是一種極強(qiáng)的梭菌毒素，可作用于腎臟、肺臟和腦等多種器官，半數(shù)致死量達(dá)到70?ng/kg，僅次于肉毒毒素和破傷風(fēng)毒素。該毒素可嵌入細(xì)胞膜形成穿孔、也可作用于神經(jīng)細(xì)胞促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，造成血管通透性增強(qiáng)，腸道上皮細(xì)胞破裂、以及腦組織中血管周圍星形膠質(zhì)細(xì)胞破裂，導(dǎo)致血管周圍水腫、顱內(nèi)壓升高和腦組織局部軟化等多種臨床癥狀（popoff?mr.epsilon?toxin:?a?fascinating?pore-forming?toxin[j].?febs?j.?2011?dec;278(23):4602-15.）。因此，實(shí)現(xiàn)etx的減毒乃至無毒的同時(shí)保留其免疫原性，進(jìn)而制備適當(dāng)?shù)囊呙绲壬镏苿哂薪?jīng)濟(jì)性和生物安全性兩方面的重要意義。
3、目前，對于牛、羊和家兔等動物通常采用傳統(tǒng)的天然毒素滅活疫苗進(jìn)行免疫預(yù)防，但缺少相關(guān)的毒素檢測和治療方法。由于天然毒素滅活疫苗抗原成分復(fù)雜，有效含量較低，容易引起動物的副反應(yīng)，導(dǎo)致無法用于犬、豬等動物的預(yù)防。已有的研究表明，通過單克隆抗體的制備，能夠?yàn)槟承┒舅氐闹委熀驮\斷的建立提供基礎(chǔ)。單克隆抗體制備的關(guān)鍵是免疫原和包被抗原，但天然毒素的制備、純化和滅活過程復(fù)雜，且具有很高的生物安全隱患。然而，李箐等研究發(fā)現(xiàn)，重組etx仍存很強(qiáng)的毒力。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)在選用天然毒素基礎(chǔ)上，利用無毒的etx單氨基酸位點(diǎn)（106位的組氨酸突變成脯氨酸）蛋白突變體（retxm1）建立間接elisa檢測方法，篩選到一系列分泌抗產(chǎn)氣莢膜梭菌etx單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，從而為后期etx抗原的檢測提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。
2、第一方面，本專利技術(shù)提供一種分泌抗產(chǎn)氣莢膜梭菌etx單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，所述雜交瘤細(xì)胞株選自保藏號cgmcc?no.?46042或cgmcc?no.?46043中的任意一種，所述細(xì)胞株分泌的單克隆抗體具有中和活性。
3、第二方面，本專利技術(shù)提供一種第一方面所述雜交瘤細(xì)胞株的篩選方法，所述篩選方法包括如下步驟：
4、s1.利用天然etx免疫小鼠，利用elisa?法測定血清效價(jià)，取效價(jià)最高小鼠脾細(xì)胞用于細(xì)胞融合；
5、s2.取s1篩選的小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合；
6、s3.利用重組etx進(jìn)行陽性克隆與亞克隆的篩選，獲得能夠分泌產(chǎn)氣莢膜梭菌etx單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
7、進(jìn)一步，在步驟s1中，所述天然etx是指滅活后的產(chǎn)氣莢膜梭菌天然etx。
8、進(jìn)一步，在步驟s2中，所述骨髓瘤細(xì)胞是指sp2/0細(xì)胞。
9、進(jìn)一步，在步驟s2中，所述融合方法為peg介導(dǎo)的化學(xué)法。
10、進(jìn)一步，在步驟s3中，所述重組etx為無毒的etx單氨基酸位點(diǎn)（本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種分泌抗產(chǎn)氣莢膜梭菌ETX單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，所述雜交瘤細(xì)胞株選自保藏號CGMCC?NO.?46042或CGMCC?NO.?46043中的任意一種，所述細(xì)胞株分泌的單克隆抗體具有中和活性。
2.一種如權(quán)利要求1所述雜交瘤細(xì)胞株的篩選方法，所述篩選方法包括如下步驟：
3.如權(quán)利要求2所述方法，在步驟S1中，所述天然ETX是指滅活后的產(chǎn)氣莢膜梭菌天然ETX；
4.如權(quán)利要求2或3任一項(xiàng)所述方法，所述篩選到的雜交瘤細(xì)胞株包括分泌中和活性的產(chǎn)氣莢膜梭菌ETX單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株和分泌無中和活性的產(chǎn)氣莢膜梭菌ETX單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。
5.一種抗產(chǎn)氣莢膜梭菌ETX單克隆抗體；所述單克隆抗體是從權(quán)利要求1所述雜交瘤細(xì)胞株的培養(yǎng)液中獲得，或用權(quán)利要求1所述雜交瘤細(xì)胞株接種到小鼠腹腔產(chǎn)生腹水而獲得。
6.一種產(chǎn)氣莢膜梭菌ETX毒素的膠體金檢測方法，所述方法中具有中和活性的單克隆抗體為金標(biāo)記抗體，無中和活性的單克隆抗體作為檢測抗體。
7.如權(quán)利要求6所述檢測方法，所述具有中和活性的單克隆抗體是由權(quán)利要求1所述
8.一種如權(quán)利要求1所述雜交瘤細(xì)胞或如權(quán)利要求5所述單克隆抗體在制備檢測產(chǎn)氣莢膜梭菌ETX的試劑中的應(yīng)用。
9.一種檢測產(chǎn)氣莢膜梭菌ETX的試劑盒，所述試劑盒包含產(chǎn)氣莢膜梭菌ETX單克隆抗體；所述單克隆抗體包括具有中和活性的產(chǎn)氣莢膜梭菌ETX單克隆抗體和無中和活性的產(chǎn)氣莢膜梭菌ETX單克隆抗體；所述具有中和活性的單克隆抗體是由權(quán)利要求1所述的具有中和活性的雜交瘤細(xì)胞株分泌的；所述無中和活性的單克隆抗體是由權(quán)利要求2篩選的無中和活性的雜交瘤細(xì)胞株分泌的。
10.如權(quán)利要求9所述試劑盒，所述試劑盒可以為ELISA檢測試劑盒、免疫組化試劑盒、免疫熒光試劑盒和/或原位雜交染色試劑盒中的一種或多種。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種分泌抗產(chǎn)氣莢膜梭菌etx單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，所述雜交瘤細(xì)胞株選自保藏號cgmcc?no.?46042或cgmcc?no.?46043中的任意一種，所述細(xì)胞株分泌的單克隆抗體具有中和活性。
2.一種如權(quán)利要求1所述雜交瘤細(xì)胞株的篩選方法，所述篩選方法包括如下步驟：
3.如權(quán)利要求2所述方法，在步驟s1中，所述天然etx是指滅活后的產(chǎn)氣莢膜梭菌天然etx；
4.如權(quán)利要求2或3任一項(xiàng)所述方法，所述篩選到的雜交瘤細(xì)胞株包括分泌中和活性的產(chǎn)氣莢膜梭菌etx單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株和分泌無中和活性的產(chǎn)氣莢膜梭菌etx單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。
5.一種抗產(chǎn)氣莢膜梭菌etx單克隆抗體；所述單克隆抗體是從權(quán)利要求1所述雜交瘤細(xì)胞株的培養(yǎng)液中獲得，或用權(quán)利要求1所述雜交瘤細(xì)胞株接種到小鼠腹腔產(chǎn)生腹水而獲得。
6.一種產(chǎn)氣莢膜梭菌etx毒素的膠體金檢測方法，所述方法中具有中和活性的單克隆抗體為金標(biāo)記抗體，無中...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：杜吉革，劉瑩，陳小云，李倩琳，韓鳳燁，
申請(專利權(quán))人：中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，
類型：發(fā)明
國別省市：
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