【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及化妝品，具體涉及一種含有干細胞提取物的護膚組合物及其制備方法和應用。
技術介紹
1、衰老是在生命過程中，整個機體的形態、結構和功能逐漸衰退的現象。人體衰老外部最明顯的表現是皮膚，皮膚是復雜的器官，其延伸遍及整個身體。隨著年齡的增長，皮膚新陳代謝的周期會逐漸加長，從25歲開始，隨著皮膚新陳代謝的速度逐漸減緩，皮膚真皮層彈力纖維開始斷裂和變形，老化的細胞不斷形成并長期停留在表皮上，無法被替換為新生細胞，使皮膚的彈性和水分都不斷減少，出現皮膚松弛形成皺紋，皮膚失去光澤等一系列問題。隨著生活水平的提高，人們對皮膚的保養追求越來越高。除了醫美整形外，大部分人更希望通過使用高品質的護膚品，溫和地讓皮膚保持年輕的狀態。因此預防和延緩皮膚衰老已成為護膚行業的研究熱點。
2、細胞老化是人體衰老的根本原因。老化的細胞對體內自由基的清除能力下降，自由基和活性氧會與皮膚中的蛋白質作用，使得蛋白質發生變性，進而使得蛋白質失去其原有的功能，這些蛋白質包括真皮層中的膠原蛋白和彈性蛋白，導致皮膚出現松弛等問題。
3、間充質干細胞是具有明顯可塑性和多向分化潛能的一種成體干細胞，存在于骨髓、脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等組織以及羊水、臍帶血中。在一定條件下可分化為骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等。研究表明，間充質干細胞具有多向分化能力，可以發揮免疫調節作用和旁分泌作用，有助于損傷組織修復。間充質干細胞的這些特點使其在護膚品領域越來越被青睞。
4、現有的添加間充質干細胞提取物的護膚品存在諸多問題，如間充質干細胞提
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于提出一種含有干細胞提取物的護膚組合物及其制備方法和應用，能明顯延長干細胞、外泌體的保存周期，提高其對皮膚的修復和改善，制得的組合物具有較好的抗衰老、美白、促進皮膚彈性、抗皺等效果，具有廣闊的應用前景。
2、本專利技術的技術方案是這樣實現的：
3、本專利技術提供一種含有干細胞提取物的護膚組合物的制備方法，將提取得到的尿源性干細胞和鹿茸干細胞混合培養于加入表皮生長因子、霍亂毒素、青霉素、鏈霉素、轉鐵蛋白、il-2和il-15的dmem培養基中，然后將培養液分離得到混合外泌體、混合干細胞和細胞外基質，混合干細胞制備成干細胞脂質體，與混合外泌體包埋于二氧化鈦/二氧化硅微球中，加入細胞外基質中，分散均勻，制得含有干細胞提取物的護膚組合物。
4、作為本專利技術的進一步改進，包括以下步驟：
5、s1.?培養基的制備：向dmem培養基中加入表皮生長因子、霍亂毒素、青霉素、鏈霉素、轉鐵蛋白、il-2和il-15，制得培養基；
6、s2.?尿源性干細胞的提取：收集新鮮的尿液過濾，離心，沉淀加入尿源性干細胞基礎培養基中重懸，培養，待貼壁細胞融合率至80-90%時，細胞傳代培養，離心，沉淀重懸細胞凍存液，凍存；
7、s3.?鹿茸干細胞的提取：取二杠茸尖部，縱向劈開取儲備間充質組織，絞碎，加入鹿茸培養基中培養，待貼壁細胞融合率至80-90%時，消化，離心，沉淀重懸細胞凍存液，凍存；
8、s4.?混合培養：將步驟s2和步驟s3中的凍存細胞解凍，離心，沉淀重懸于培養基中，混合培養，制得混合培養液；
9、s5.?混合外泌體的提取：將混合培養液離心，分別收集沉淀和上清液，沉淀為混合干細胞，重懸于新鮮的培養基中，得到干細胞混懸液，上清液經過超高速離心法結合超濾管法分離得到混合外泌體和細胞外基質；
10、s6.?干細胞脂質體的制備：將卵磷脂、膽固醇溶于混合溶液中，滴加干細胞混懸液，恒溫攪拌，旋轉蒸發，超聲分散均勻，冷凍干燥，制得干細胞脂質體；
11、s7.?負載二氧化鈦/二氧化硅微球的制備：將鈦酸四丁酯、正硅酸烷基酯加入有機溶劑中，得到油相；將致孔劑和表面活性劑加入水中，加入干細胞脂質體、混合外泌體，超聲分散均勻，制得水相；將水相滴加入油相中，乳化，調節溶液ph值，攪拌反應，離心，洗滌，干燥，制得負載二氧化鈦/二氧化硅微球；
12、s8.?護膚組合物的制備：將負載二氧化鈦/二氧化硅微球加入細胞外基質中，超聲分散均勻，制得含有干細胞提取物的護膚組合物。
13、作為本專利技術的進一步改進，步驟s1中所述表皮生長因子的添加量為3-5μg/l，霍亂毒素的添加量為25-35μg/l，青霉素的添加量為80-120u/ml，鏈霉素的添加量為0.8-1.2g/l，轉鐵蛋白的添加量為3-5mg/l，il-2的添加量為1-2mg/l，il-15的添加量為0.7-1.5mg/l；步驟s2中所述離心的轉速為1000-2000r/min，時間為10-20min，所述尿源性干細胞基礎培養基由3/4?dmem培養基、1/4?ham's?f-12培養基混合組成，所述培養的條件為36-38℃，4-6v/v%co2條件下培養，所述細胞傳代培養至第3-4代，所述細胞凍存液為培養基:胎牛血清:二甲基亞砜按照體積比5-7：2-4:1的混合液。
14、作為本專利技術的進一步改進，步驟s3中所述鹿茸培養基為含8-12wt%胎牛血清的dmem培養基，所述培養的條件為36-38℃，4-6v/v%co2條件下培養，所述消化為加入胰蛋白酶至體系含量為0.1-0.2wt%，消化1-3min，所述離心的轉速為1000-2000r/min，時間為10-20min；步驟s4中所述解凍為室溫融化，所述離心的轉速為1000-2000r/min，時間為10-20min，所述混合培養的條件為36-38℃，4-6v/v%co2條件下培養3-5d。
15、作為本專利技術的進一步改進，步驟s5中所述離心的轉速為1000-2000r/min，時間為10-20min，所述干細胞混懸液的細胞含量為104-105個/ml，所述超高速離心法結合超濾管法方法如下：細胞上清液3-5℃，3000-4000r/min離心15-20min除去細胞碎片等，超濾管濃縮上清液，3-5℃，12000-15000r/min離心20-30min除去大囊泡和蛋白，上清液用0.22μm濾膜過濾，最后3-5℃，30000-35000r/min離心60-70min，ph=6.7-7的pbs重懸沉淀，3-5℃，30000-35000r/min再次離心60-70min，得到的沉淀即外泌體，上清液為細胞外基質，用ph=6.7-7的pbs重懸，-80℃冰箱凍存。
16、作為本專利技術的進一步改進，步驟s6中所述卵磷脂、膽固醇、干細胞混懸液的質量比為10-12:7-10:20-30，所述混合溶液為二氯甲烷和乙醇按照體積比為10:3-5的混合溶液，所述恒溫攪拌的溫度為35-37℃，時間為20-30min。
17、作為本專利技術的進一步改進，步驟s7中所述鈦酸四丁酯、正硅酸本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種含有干細胞提取物的護膚組合物的制備方法，其特征在于，將提取得到的尿源性干細胞和鹿茸干細胞混合培養于加入表皮生長因子、霍亂毒素、青霉素、鏈霉素、轉鐵蛋白、IL-2和IL-15的DMEM培養基中，然后將培養液分離得到混合外泌體、混合干細胞和細胞外基質，混合干細胞制備成干細胞脂質體，與混合外泌體包埋于二氧化鈦/二氧化硅微球中，加入細胞外基質中，分散均勻，制得含有干細胞提取物的護膚組合物。
2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟S1中所述表皮生長因子的添加量為3-5μg/L，霍亂毒素的添加量為25-35μg/L，青霉素的添加量為80-120U/mL，鏈霉素的添加量為0.8-1.2g/L，轉鐵蛋白的添加量為3-5mg/L，IL-2的添加量為1-2mg/L，IL-15的添加量為0.7-1.5mg/L；步驟S2中所述離心的轉速為1000-2000r/min，時間為10-20min，所述尿源性干細胞基礎培養基由3/4?DMEM培養基、1/4?Ham's?F-12培養基混合組成，所述培養的條件
4.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟S3中所述鹿茸培養基為含8-12wt%胎牛血清的DMEM培養基，所述培養的條件為36-38℃，4-6v/v%CO2條件下培養，所述消化為加入胰蛋白酶至體系含量為0.1-0.2wt%，消化1-3min，所述離心的轉速為1000-2000r/min，時間為10-20min；步驟S4中所述解凍為室溫融化，所述離心的轉速為1000-2000r/min，時間為10-20min，所述混合培養的條件為36-38℃，4-6v/v%CO2條件下培養3-5d。
5.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟S5中所述離心的轉速為1000-2000r/min，時間為10-20min，所述干細胞混懸液的細胞含量為104-105個/mL，所述超高速離心法結合超濾管法方法如下：細胞上清液3-5℃，3000-4000r/min離心15-20min除去細胞碎片等，超濾管濃縮上清液，3-5℃，12000-15000r/min離心20-30min除去大囊泡和蛋白，上清液用0.22μm濾膜過濾，最后3-5℃，30000-35000r/min離心60-70min，pH=6.7-7的PBS重懸沉淀，3-5℃，30000-35000r/min再次離心60-70min，得到的沉淀即外泌體，上清液為細胞外基質，用pH=6.7-7的PBS重懸，-80℃冰箱凍存。
6.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟S6中所述卵磷脂、膽固醇、干細胞混懸液的質量比為10-12:7-10:20-30，所述混合溶液為二氯甲烷和乙醇按照體積比為10:3-5的混合溶液，所述恒溫攪拌的溫度為35-37℃，時間為20-30min。
7.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟S7中所述鈦酸四丁酯、正硅酸烷基酯、致孔劑、表面活性劑、干細胞脂質體、混合外泌體的質量比為10-14:3-5:1-2:0.5-1:8-10:3-5，所述調節溶液pH值為9-10，所述正硅酸烷基酯為正硅酸甲酯或正硅酸乙酯，所述致孔劑為十六烷基三甲基氯化銨或十六烷基三甲基溴化銨，所述表面活性劑選自吐溫-20、吐溫-40、吐溫-60、吐溫-80、吐溫-85中的至少一種。
8.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟S8中所述負載二氧化鈦/二氧化硅微球、細胞外基質的質量比為10-12:25-30。
9.一種如權利要求1-8任一項所述的制備方法制得的含有干細胞提取物的護膚組合物。
10.一種如權利要求9所述含有干細胞提取物的護膚組合物在制備抗衰老、保濕、美白、防紫外輻射化妝品中的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種含有干細胞提取物的護膚組合物的制備方法，其特征在于，將提取得到的尿源性干細胞和鹿茸干細胞混合培養于加入表皮生長因子、霍亂毒素、青霉素、鏈霉素、轉鐵蛋白、il-2和il-15的dmem培養基中，然后將培養液分離得到混合外泌體、混合干細胞和細胞外基質，混合干細胞制備成干細胞脂質體，與混合外泌體包埋于二氧化鈦/二氧化硅微球中，加入細胞外基質中，分散均勻，制得含有干細胞提取物的護膚組合物。
2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟s1中所述表皮生長因子的添加量為3-5μg/l，霍亂毒素的添加量為25-35μg/l，青霉素的添加量為80-120u/ml，鏈霉素的添加量為0.8-1.2g/l，轉鐵蛋白的添加量為3-5mg/l，il-2的添加量為1-2mg/l，il-15的添加量為0.7-1.5mg/l；步驟s2中所述離心的轉速為1000-2000r/min，時間為10-20min，所述尿源性干細胞基礎培養基由3/4?dmem培養基、1/4?ham's?f-12培養基混合組成，所述培養的條件為36-38℃，4-6v/v%co2條件下培養，所述細胞傳代培養至第3-4代，所述細胞凍存液為培養基:胎牛血清:二甲基亞砜按照體積比5-7：2-4:1的混合液。
4.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟s3中所述鹿茸培養基為含8-12wt%胎牛血清的dmem培養基，所述培養的條件為36-38℃，4-6v/v%co2條件下培養，所述消化為加入胰蛋白酶至體系含量為0.1-0.2wt%，消化1-3min，所述離心的轉速為1000-2000r/min，時間為10-20min；步驟s4中所述解凍為室溫融化，所述離心的轉速為1000-2000r/min，時間為10-20min，所述混合培養的條件為36-38℃，4-6v/v%co2條件下培養3-5d。
5.根據權利要求2所述的制備方法，其...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王壯，雷起鳳，梁玉倩，尹娜，楊俊麗，
申請(專利權)人：北京青藤谷禧干細胞科技研究院有限公司，
類型：發明
國別省市：
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