【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物疫苗，具體涉及一株雞馬立克氏病病毒mir-m6-5p基因缺失株及其應用。
技術介紹
1、雞馬立克氏病(marek’s?disease,md)是由雞馬立克氏病病毒(marek’s?diseasevirus,mdv)引起的禽類高度接觸性腫瘤性疫病。mdv在世界各地養禽的國家和地區廣泛流行，給養禽業造成了嚴重的經濟損失。mdv感染會引起免疫抑制，提高家禽對其他病原體的易感性，產生混合感染，不僅造成家禽生產性能下降，還可能直接導致家禽死亡，已成為影響我國養禽業的重要疫病之一。
2、當前md的主要防控措施是接種cvi988弱毒疫苗。然而，近些年來高致病性mdv變異株不斷在中國出現，導致家禽出現更高的死亡率和腫瘤發生率。家禽在接種cvi988弱毒疫苗后感染某些高致病性mdv流行毒株仍會出現70％左右的發病率和50％以上的死亡率，給當前的疾病防控帶來了新的挑戰。此外，作為嚴格的細胞結合毒，mdv疫苗在生產過程中需要制備原代雞胚成纖維細胞(cef)以培養病毒，病毒在cef上的復制滴度直接影響生產成本。盡管經過多年生產工藝的優化，mdv疫苗病毒在培養過程中的病毒滴度仍然明顯低于其他禽病病毒。
3、micrornas(mirnas)是一類長度為20-25核苷酸的單鏈非編碼rna。mirnas和ago2等蛋白形成的mirna介導的沉默復合體(risc)通過堿基互補配對識別并結合在mirna靶基因的mrna上，然后通過降解靶基因mrna或抑制翻譯實現轉錄后調控的作用。和其它皰疹病毒一樣，mdv自身能夠編碼mir
技術實現思路
1、本專利技術的目的是降低雞馬立克氏病疫苗的生產成本以及雞馬立克氏病病毒導致的腫瘤發生率。
2、為達到上述目的，本專利技術提供一株雞馬立克氏病病毒mir-m6-5p基因缺失株，其保藏編號為cgmcc?no.46202。
3、所述雞馬立克氏病病毒mir-m6-5p基因缺失株缺失的mir-m6-5p基因的核苷酸序列為tctgttgttccgtagtgttctc。
4、所述雞馬立克氏病病毒mir-m6-5p基因缺失株在雞馬立克氏病疫苗的制備中的應用也屬于本專利技術的保護范圍。
5、本專利技術還提供包含所述雞馬立克氏病病毒mir-m6-5p基因缺失株的病毒液。
6、本專利技術還提供包含所述雞馬立克氏病病毒mir-m6-5p基因缺失株的疫苗。
7、優選地，所述疫苗為活疫苗。
8、優選地，所述疫苗的接種劑量為每只雞2000～2500pfu。
9、本專利技術還提供一種制備雞馬立克氏病疫苗的方法，其包括：用所述雞馬立克氏病病毒mir-m6-5p基因缺失株感染雞胚成纖維細胞，培養細胞并收獲病毒。
10、上述方法中，可將感染了所述雞馬立克氏病病毒mir-m6-5p基因缺失株的雞胚成纖維細胞置于37℃、5％co2培養箱中培養。
11、上述方法中，當所述雞胚成纖維細胞出現70％～80％病變時收獲病毒。
12、本專利技術提供的雞馬立克氏病病毒mir-m6-5p基因缺失株被命名為rb1b-δmir-m6-5p，是去除了mir-m6-5p基因的重組雞馬立克氏病病毒rb1b株。體外生物學特性研究結果顯示，與雞馬立克氏病病毒rb1b株相比，rb1b-δmir-m6-5p感染細胞后72-120小時的復制水平顯著增加(實驗例3)。動物實驗結果表明，與感染雞馬立克氏病病毒rb1b株的雞只相比，感染rb1b-δmir-m6-5p的雞只的腫瘤發生率降低(實驗例4)。因此，將本專利技術提供的rb1b-δmir-m6-5p應用于雞馬立克氏病疫苗的研發，可降低疫苗生產成本和免疫雞只的腫瘤發生率，在雞馬立克氏病的預防中具有良好的應用前景。
13、所述雞馬立克氏病病毒mir-m6-5p基因缺失株的專利保藏信息如下：
14、生物材料(株)：mdv1-δmir-m6-5p
15、分類命名：雞馬立克氏病病毒
16、保藏日期：2024年10月10日
17、保藏編號：cgmcc?no.46202
18、保藏機構：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(cgmcc)
19、地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所。
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1.雞馬立克氏病病毒miR-M6-5p基因缺失株，其保藏編號為CGMCC?No.46202。
2.根據權利要求1所述的雞馬立克氏病病毒miR-M6-5p基因缺失株，其特征在于，其缺失的miR-M6-5p基因的核苷酸序列為TCTGTTGTTCCGTAGTGTTCTC。
3.權利要求1所述的雞馬立克氏病病毒miR-M6-5p基因缺失株在雞馬立克氏病疫苗的制備中的應用。
4.包含權利要求1所述的雞馬立克氏病病毒miR-M6-5p基因缺失株的病毒液。
5.包含權利要求1所述的雞馬立克氏病病毒miR-M6-5p基因缺失株的疫苗。
6.根據權利要求5所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗為活疫苗。
7.根據權利要求6所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗的接種劑量為每只雞2000～2500PFU。
8.一種制備雞馬立克氏病疫苗的方法，其包括：用權利要求1所述的雞馬立克氏病病毒miR-M6-5p基因缺失株感染雞胚成纖維細胞，培養細胞并收獲病毒。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，將感染了所述雞馬立克氏病
10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于，當所述雞胚成纖維細胞出現70％～80％病變時收獲病毒。
...【技術特征摘要】
1.雞馬立克氏病病毒mir-m6-5p基因缺失株，其保藏編號為cgmcc?no.46202。
2.根據權利要求1所述的雞馬立克氏病病毒mir-m6-5p基因缺失株，其特征在于，其缺失的mir-m6-5p基因的核苷酸序列為tctgttgttccgtagtgttctc。
3.權利要求1所述的雞馬立克氏病病毒mir-m6-5p基因缺失株在雞馬立克氏病疫苗的制備中的應用。
4.包含權利要求1所述的雞馬立克氏病病毒mir-m6-5p基因缺失株的病毒液。
5.包含權利要求1所述的雞馬立克氏病病毒mir-m6-5p基因缺失株的疫苗。
6.根據權...
【專利技術屬性】
技術研發人員：周林宜，李永清，江波，程晶，劉文曉，
申請(專利權)人：北京市農林科學院，
類型：發明
國別省市：
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