【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于基因工程。
技術介紹
1、基于ivt(in?vitro?transcription，體外轉錄)的合成平臺、核苷酸化學、傳遞系統等相關技術的快速發展，使得針對不同疾病的mrna藥物迅速開發。傳統上，mrna是通過ivt反應合成的，使用t3、t7或sp6?rna聚合酶催化線性化質粒dna在5’→3’方向上形成rna。dna模板包含啟動子、5’非翻譯區(5’utr)、開放閱讀框架(orf)、3’非翻譯區(3’utr)和一個poly?a尾。
2、質粒dna可以以三種構象存在：1)超螺旋(sc)，通常也稱為共價閉合環狀dna(ccc)；2)開環(oc)dna；和3)線性dna。此外，質粒通常以多聚體的形式出現，這是由于在宿主細菌中發生同源重組或連續復制造成的。
3、工業上，需要持續提供序列穩定的質粒dna，以進行ivt?mrna生產。因此，應當避免菌株、質粒發生改變。此外，當菌株出現污染時，也需要確保有備份菌株以確保后續質粒生產。基于以上需求，需要建立菌株細胞庫(cell?bank)以為質粒dna的生產提供檢定合格、質量相同、能持續穩定傳代的細胞。
4、工業生產中，細胞庫主要分為實驗細胞庫(research?cell?bank,rcb)、原始細胞庫(pre-master?cell?bank,pcb)、主代細胞庫(master?cell?bank,mcb)和工作細胞庫(work?cell?bank,wcb)。其中，rcb的構建方法主要包括：將測序正確的質粒轉化至宿主細胞(如大腸桿菌細胞)，經
5、用篩選得到的rcb做種子，進行pcb建庫：取一支rcb室溫化凍，混勻后按照一定的比例接種至培養基，經適宜條件培養至菌液變渾濁，再加入等體積的甘油溶液混勻、分裝，先暫存于超低溫冰箱中過夜，再轉入液氮中長期保存。之后進行mcb與wcb的制備：取一支pcb/mcb甘油菌室溫化凍，混勻后按照一定的比例接種至培養基，經適宜條件培養至菌液變渾濁，再加入等體積的甘油溶液混勻、分裝。mcb在超低溫冰箱中保存12～48h后再轉移至液氮罐中長期保存；wcb則直接在超低溫冰箱中長期保存。
6、專利技術人發現，在構建rcb、pcb、mcb和wcb，以及使用wcb發酵生產質粒過程中，由于質粒在宿主細菌中進行多次復制，從而降低了模板質粒poly?a尾的完整性。具體表現在使用wcb生產的質粒體外轉錄時會產生含有不同長度poly?a尾的mrna，從而降低mrna原料藥的均一性或純度。因此，亟需建立一種在細胞傳代過程中保持mrna轉錄用質粒序列穩定性的方法。
7、為了解決以上問題，專利技術人發現，將外源mrna生產質粒轉入大腸桿菌感受態細胞后，根據大腸桿菌中質粒的拓撲結構，可以將轉化后的大腸桿菌分為以下三個類別：1)第i類克隆，其中質粒超螺旋單體大于10％；2)第ii類克隆，其中質粒超螺旋單體小于10％、質粒超螺旋二聚體為10-100％；和第iii類克隆，其中質粒超螺旋單體小于10％、質粒超螺旋二聚體小于10％。專利技術人發現，第ii類克隆在多次傳代后，質粒拓撲結構基本保持不變，質粒產量更高，質粒中poly?a完整性優于第i類和第iii類克隆。以多次傳代后的細胞生產質粒，并經線性化后轉錄得到的mrna，其純度與細胞表達也優于其余兩類克隆。以上結果表明，通過本專利技術方法得到的第ii類克隆在多次傳代后質粒產量更高，在多次傳代過程中能保持質粒poly?a尾的結構完整性，以此線性化質粒為模板轉錄得到的mrna純度與細胞表達效果更好。本專利技術為ivt反應中質粒的選擇提供了一種新的思路，可以用于構建用于mrna商業化生產的相關細胞庫(如rcb、pcb、mcb和wcb)。
技術實現思路
1、在本專利技術的一個方面中，本專利技術提供一種分離的含有外源質粒的大腸桿菌細胞群，所述外源質粒可以在體外轉錄為mrna，所述外源質粒包含質粒骨架、調控外源編碼基因的啟動子(如t7啟動子、sp6啟動子、t3啟動子或t5啟動子)、5’非翻譯區(5’utr)、外源編碼基因、3’非翻譯區(3’utr)和polya尾巴，其中所述外源質粒在大腸桿菌細胞群中的拓撲結構占比為：質粒超螺旋單體小于10％(優選小于5％，更優選小于2％，最優選小于1％)、質粒超螺旋二聚體為10-100％(優選30-100％，更優選40-100％，更優選50-100％，更優選60-80％，更優選70-80％，更優選70-90％)。
2、在一個實施方案中，所述質粒骨架為pvax1(如seq?id?no：1所示)或pdna2.0(atum公司)。
3、本專利技術中，術語“質粒骨架”為不包含不包含調控外源編碼基因的啟動子、5’utr、外源編碼基因、3’utr和polya尾巴的質粒載體。可以將前述不包含調控外源編碼基因的啟動子、5’utr、外源編碼基因、3’utr和polya尾巴及線性化酶切位點以本領域常規手段插入到質粒骨架中，以制備本專利技術的mrna體外轉錄用質粒。
4、本專利技術中，調控外源編碼基因的啟動子可以是t7啟動子。
5、在一個實施方案中，所述外源編碼基因編碼感興趣的肽或蛋白質，優選選自下組：細胞因子(例如白介素(優選il-12或il-2或il-7))；例如促紅細胞生成素；黏附分子，例如整聯蛋白；免疫球蛋白；免疫活性化合物，例如抗原，例如腫瘤相關抗原、病原體相關抗原(例如，一種或更多種(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10種)病毒抗原，例如一種或更多種(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10種)人乳頭瘤病毒(hpv)抗原、猴痘病毒抗原、流感病毒(a、b或c)抗原、cmv抗原或rsv抗原)、變應原或自身抗原；激素，例如加壓素、胰島素或生長激素；生長因子，例如vegfa；酶，例如單純皰疹病毒1型胸苷激酶(hsv1-tk)、氨基己糖苷酶、苯丙氨酸羥化酶、假膽堿酯酶、胰酶或乳糖酶；受體，例如生長因子受體；蛋白酶抑制劑，例如α1-抗胰蛋白酶；凋亡調節劑，例如bax；轉錄因子，例如foxp3；腫瘤抑制蛋白，例如p53；結構蛋白，例如表面活性型蛋白質；重編程因子，例如oct4、sox2、c-myc、klf4、lin28或nanog；基因組改造蛋白，例如成簇規本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種分離的含有外源質粒的大腸桿菌細胞群，所述外源質粒可以在體外轉錄為mRNA，所述外源質粒包含質粒骨架、啟動子(優選為T7啟動子、SP6啟動子、T3啟動子或T5啟動子)、5’非翻譯區(5’UTR)、外源編碼基因、3’非翻譯區(3’UTR)和polyA尾巴，其中所述大腸桿菌細胞群中所述外源質粒的拓撲結構占比為：質粒超螺旋單體在質粒超螺旋單體、質粒超螺旋二聚體、質粒超螺旋三聚體和質粒超螺旋四聚體之和中的比例小于10％(優選小于5％，更優選小于2％，最優選小于1％)、質粒超螺旋二聚體在質粒超螺旋單體、質粒超螺旋二聚體、質粒超螺旋三聚體和質粒超螺旋四聚體之和中的比例為10-100％(優選30-100％，更優選40-100％，更優選50-100％，更優選60-80％，更優選70-80％，更優選70-90％)，
2.一種研究細胞庫(RCB)的制備方法，其包括：將權利要求1所述的大腸桿菌細胞群與冷凍保護劑(優選為30-70％甘油(v/v)，更優選40％-50％(v/v)甘油)混合后分裝(優選1mL/支)，從而制備得到所述RCB；優選地，
3.一種原始細胞庫(PCB)
4.一種主代細胞庫(MCB)的制備方法，其包括：將權利要求3所述的PCB化凍，混勻后，接種到抗生素抗性培養基(優選為LB抗生素抗性培養基，更優選為LB?Kan)中，放置在恒溫培養振蕩器中約37℃，約220rpm培養約12h，加入冷凍保護劑(優選為30-70％甘油(v/v)，更優選40-50％甘油(v/v))后混勻，和分裝后保存，從而得到主代細胞庫(MCB)；優選地，
5.一種工作細胞庫(WCB)的制備方法，其包括：將權利要求4所述的MCB化凍，混勻后，接種到抗生素抗性培養基(優選為LB抗生素抗性培養基，更優選為LB?Kan)中，放置在恒溫培養振蕩器中約37℃，約220rpm培養約12h，加入冷凍保護劑(優選為30-70％甘油(v/v)，更優選40-50％甘油(v/v))后混勻，和分裝后保存，從而得到工作細胞庫(WCB)；優選地，
6.由權利要求2所述方法制備得到的研究細胞庫(RCB)、由權利要求3所述方法制備得到的原始細胞庫(PCB)、由權利要求4所述方法制備得到的主代細胞庫(MCB)，或者由權利要求5所述方法制備得到的工作細胞庫(WCB)。
7.一種質粒的生產方法，所述質粒能夠在體外轉錄出含polyA尾巴的mRNA，所述方法包括：
8.一種體外轉錄生產含polyA尾巴的mRNA的方法，所述方法包括：
9.一種提高體外轉錄生產的mRNA純度的方法，所述mRNA包含polyA尾巴，所述方法包括：
10.一種提高質粒產量的方法，所述質粒能夠在體外轉錄出含polyA尾巴的mRNA，所述方法包括：
11.權利要求10或權利要求11的方法，其中
...【技術特征摘要】
1.一種分離的含有外源質粒的大腸桿菌細胞群，所述外源質粒可以在體外轉錄為mrna，所述外源質粒包含質粒骨架、啟動子(優選為t7啟動子、sp6啟動子、t3啟動子或t5啟動子)、5’非翻譯區(5’utr)、外源編碼基因、3’非翻譯區(3’utr)和polya尾巴，其中所述大腸桿菌細胞群中所述外源質粒的拓撲結構占比為：質粒超螺旋單體在質粒超螺旋單體、質粒超螺旋二聚體、質粒超螺旋三聚體和質粒超螺旋四聚體之和中的比例小于10％(優選小于5％，更優選小于2％，最優選小于1％)、質粒超螺旋二聚體在質粒超螺旋單體、質粒超螺旋二聚體、質粒超螺旋三聚體和質粒超螺旋四聚體之和中的比例為10-100％(優選30-100％，更優選40-100％，更優選50-100％，更優選60-80％，更優選70-80％，更優選70-90％)，
2.一種研究細胞庫(rcb)的制備方法，其包括：將權利要求1所述的大腸桿菌細胞群與冷凍保護劑(優選為30-70％甘油(v/v)，更優選40％-50％(v/v)甘油)混合后分裝(優選1ml/支)，從而制備得到所述rcb；優選地，
3.一種原始細胞庫(pcb)的制備方法，其包括：將權利要求2所述的rcb化凍，接種到抗生素抗性培養基(優選為lb抗生素抗性培養基，更優選為lb?kan)中，在搖床中約37℃，約220rpm培養約12h，加入冷凍保護劑(優選為30-70％甘油(v/v)，更優選40-50％甘油(v/v))后混勻，和分裝后保存，從而得到原始細胞庫(pcb)；優選地，
4.一種主代細胞庫(mcb)的制備方法，其包括：將權利要求...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王德華，特奧得琳達·米拉貝拉，韋浩楠，亓娟，李翠翠，
申請(專利權)人：南京吉邁生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：
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