【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物醫藥，具體涉及一種肺纖維化模型及其構建方法，該肺纖維化模型在藥物檢測、藥物篩選和/或檢測病原體感染對肺組織纖維化發展進程的影響中的用途，一種培養基組合，以及一種藥物檢測方法、藥物篩選方法和/或檢測病原體感染對肺組織纖維化發展進程的影響的方法。
技術介紹
1、肺纖維化是間質性肺疾病終末期的一種類型。已知有多種因素可導致肺纖維化，包括毒性、自身免疫性、藥物性、感染性、創傷性損傷等。肺纖維化的特征為成纖維細胞增殖、細胞外基質聚集、炎癥損傷和組織結構的破壞。研究表明，肺纖維化患者的中位生存期僅2～5年，5年存活率只有20％。
2、既往肺纖維化的研究主要集中在成纖維細胞體外2d培養和動物模型方面。然而這些方面各有弊端。其中，當成纖維細胞培養在培養皿或玻片時(2d)，不能很好地展示細胞結構、黏附性、機械傳導和可溶性細胞因子的信號轉導，同時無法模擬體內細胞－細胞/基質之間的相互作用。對于動物模型而言，由于存在物種差異，且人為誘發纖維化疾病只能模擬纖維化病程中的某一階段，無法展示疾病的全部發展過程，因此在動物模型中顯示出可緩解纖維化的藥物絕大部分在臨床ii/iii期實驗時都以失敗告終。
3、因此尋找新的、更能模擬體內肺微環境的肺纖維化模型以用于肺纖維化疾病的研究和藥物篩選等方面顯得極為迫切。
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于，通過提供一種肺纖維化模型的構建方法，該構建方法構建的肺纖維化模型可更好地模擬肺泡——毛細血管屏障的功能及其結構特征，并且可具有
2、具體地，第一方面，本專利技術提供了一種肺纖維化模型的構建方法，其包括：
3、提供肺類器官和細胞培養容器；
4、將所述肺類器官接種于所述細胞培養容器的上層，在所述細胞培養容器的上層和下層加入肺上皮細胞培養基，以液-液模式培養所述肺類器官；
5、棄除所述上層和所述下層中的所述肺上皮細胞培養基，使所述上層保持干燥，并在所述下層加入新鮮的所述肺上皮細胞培養基，以進行第一階段氣-液模式培養所述肺類器官；
6、將內皮細胞接種于所述細胞培養容器的下層，再將巨噬細胞接種于所述細胞培養容器的上層并進行第二階段氣-液模式培養，得到肺體外模型；
7、使用肺纖維化誘導劑處理所述肺體外模型，得到肺纖維化模型。
8、本專利技術中，所述細胞培養容器為至少可以分為上層和下層(有時也稱上室和下室)培養單元的培養容器，從而實現細胞遷移或根據需求使不同細胞在不同層生長甚至貼附于位于上下兩層之間的膜(例如，多孔膜)上，相應地，所得肺纖維化模型也可分為上層(即，模型上層)和下層(即，模型下層)。在一些實施方案中，所述細胞培養容器為transwell孔板或細胞培養芯片，例如膜式芯片、屏障芯片。其中，當使用細胞培養芯片時，所得的肺纖維化模型也稱為肺芯片(lung-on-a-chip，loc)模型。在一些具體實施方案中，所述膜式芯片例如為申請號為202321349258.3、202330709231.x或者202222062961.8中公開的那些，所述屏障芯片例如為202211680988.1、202222130269.4或者202222130382.2中公開的那些，并且這些申請文件以全文引用的方式并入本文。
9、本專利技術中，所述肺類器官可以是原代提取得到的肺類器官，也可以是由誘導性多能干細胞(ips)通過分化得到的肺類器官。所述原代提取可以是從哺乳動物的肺組織進行提取，所述哺乳動物例如為人、家養動物、農場動物以及動物園、運動場或寵物動物，比如狗、貓、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、馬、牛、奶牛等。
10、本專利技術中，“液-液模式培養”指的是在所述細胞培養容器的上層和下層均添加有液體(例如培養基)的培養模式。“氣-液模式培養”一般指的是僅在所述細胞培養容器的下層添加有液體(例如培養基)，此時上層保持干燥的培養模式。
11、本專利技術的構建方法中，以肺類器官取代傳統的細胞系來構建肺纖維化模型，通過對肺類器官進行先液-液模式、再氣-液模式培養(即，第一階段氣-液模式培養)，然后按照內皮細胞、巨噬細胞的順序依次進行接種，且巨噬細胞進行第二階段氣-液模式培養，有利于使肺纖維化模型更加成熟，提高其仿真性。
12、在一些實施方案中，所述肺類器官是原代提取得到的肺類器官。可以采用本領域已知的方法進行提取，優選地采用如下步驟進行提取：
13、(1)清洗：以緩沖液清洗正常肺組織，去除表面黏膜；所述緩沖液優選加入青鏈霉素和慶大霉素；
14、(2)破碎：將肺組織剁碎至肉糜狀，緩沖液重懸，靜置后棄上清；
15、(3)消化：加入肺原代組織消化液，吹打混勻后使用金屬浴震蕩儀37℃(可使用其他同類型設備替代)，震蕩消化30～60min，消化成小的細胞團，最后加入緩沖液終止消化；所述肺原代組織消化液可使用商業化的肺原代組織消化液，優選地，所述肺原代組織消化液包含膠原酶和培養基，其中所述膠原酶包括：膠原酶i、膠原酶ii、膠原酶iv中的一種或多種，所述膠原酶i、膠原酶ii、膠原酶iv中的任一種在所述肺原代消化液中的終濃度為1～2mg/ml，所述培養基為dmem或advanced?dmem/f12；
16、(4)重懸：消化后的細胞懸液通過100μm的細胞篩網過濾，使用肺類器官培養基重懸細胞，并計數；其中，所述肺類器官培養基可采用商業化的肺類器官培養基，例如博庚公司生產的呼吸道類器官擴增培養基(貨號a01-001)，或者艾瑋得公司生產的肺類器官培養試劑盒(貨號klu0201)；
17、(5)鋪板：離心，使用細胞外基質(matrigel，bme等)重懸肺類器官，進行鋪板。加入肺類器官培養基，放入37℃培養箱培養。
18、在一些實施例方案中，在接種各類細胞前可以對所述細胞培養容器進行預處理以便于細胞貼壁。預處理方法可采用本領域已知的那些，例如，采用包括細胞外基質的溶液進行預處理，其中細胞外基質可采用matrigel、膠原、纖連蛋白等，此處不做限定。
19、在一些實施方案中，在接種之前，使用類器官傳代消化液(胰蛋白酶、tryple或accutase細胞消化液等)消化所述肺類器官，使其形成單細胞后加入肺類器官培養基終止消化，然后進行接種。
20、在一些實施方案中，所述肺類器官接種于所述細胞培養容器的上層的步驟中，以接種面積(例如，細胞培養芯片中膜的面積)計算，所述肺類器官接種1×105～10×105個細胞/cm2。
21、在一些實施方案中，在所述細胞培養容器的上層和下層加入肺上皮細胞培養基的步驟中，所述肺上皮細胞培養基可采用商業化的肺上皮細胞培養基。本專利技術中，所述肺上皮細胞培養基包括肺類器官培養基。在一些具體實施例中，所述肺上皮細胞培養基例如為博庚公司生產的呼吸道類器官擴增培養基(貨號a01-001)、艾瑋得公司生產的肺類器官培養試劑盒(貨號klu0201)或者ste本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種肺纖維化模型的構建方法，其包括：
2.根據權利要求1所述的構建方法，其中，所述液-液模式培養所述肺類器官的時間為3～7天；
3.根據權利要求1或2所述的構建方法，其中，
4.根據權利要求1～3任一項所述的構建方法，其中，將內皮細胞接種于所述細胞培養容器的下層的步驟中，待內皮細胞貼壁后，在所述下層加入第一混合培養基，所述第一混合培養基為所述肺上皮細胞培養基與內皮細胞培養基按照(0.5～3.5):1的體積比混合得到；
5.根據權利要求1～4任一項所述的構建方法，其中，將所述巨噬細胞接種于所述細胞培養容器的上層并進行第二階段氣液模式培養后，還包括將免疫細胞接種于所述細胞培養容器的下層并培養的步驟；
6.根據權利要求1～5任一項所述的構建方法，其中，所述細胞培養容器為Transwell或細胞培養芯片，例如膜式芯片、屏障芯片。
7.一種肺纖維化模型，其由權利要求1～6任一項所述的構建方法構建得到。
8.一種培養基組合，其包含肺上皮細胞培養基、第一混合培養基和第三混合培養基，以及可選地第二混合培養基和
9.權利要求1～6任一項所述構建方法構建得到的肺纖維化模型，或權利要求7所述的肺纖維化模型在以下(a)或(b)中的用途；
10.根據權利要求9所述的用途，其中，所述(a)和(b)包括如下(i)～(xii)中的至少一種：
11.一種藥物檢測方法、藥物篩選方法和/或檢測病原體感染對肺組織纖維化發展進程的影響的方法，其包括：
...【技術特征摘要】
1.一種肺纖維化模型的構建方法，其包括：
2.根據權利要求1所述的構建方法，其中，所述液-液模式培養所述肺類器官的時間為3～7天；
3.根據權利要求1或2所述的構建方法，其中，
4.根據權利要求1～3任一項所述的構建方法，其中，將內皮細胞接種于所述細胞培養容器的下層的步驟中，待內皮細胞貼壁后，在所述下層加入第一混合培養基，所述第一混合培養基為所述肺上皮細胞培養基與內皮細胞培養基按照(0.5～3.5):1的體積比混合得到；
5.根據權利要求1～4任一項所述的構建方法，其中，將所述巨噬細胞接種于所述細胞培養容器的上層并進行第二階段氣液模式培養后，還包括將免疫細胞接種于所述細胞培養容器的下層并培養的步驟；
6.根據權利要求...
【專利技術屬性】
技術研發人員：請求不公布姓名，請求不公布姓名，請求不公布姓名，請求不公布姓名，請求不公布姓名，請求不公布姓名，
申請(專利權)人：江蘇艾瑋得生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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