【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及尿路感染檢測，具體為一種基于噬菌體的尿路感染快速精準檢測方法。
技術介紹
1、尿路感染是全球范圍內最常見的感染性疾病之一，造成了相當大的經濟和公共衛生負擔。其中，大腸桿菌占所有尿路感染的70-95％。
2、目前，診斷尿路感染的金標準是出現癥狀并伴有尿培養陽性。尿培養作為金標準的優點是能夠識別和驗證活菌群，但影響因素多，漏檢率高，檢測周期長，從采集臨床樣本到藥敏試驗結果總共至少需要42～78h，可能錯過患者的最佳治療時間并加劇抗生素耐藥性，且其隨后的生化鑒定需要專業的設備和操作人員。其他用于檢測尿液中細菌的方法主要有革蘭染色后顯微鏡檢、試紙檢測以及尿沉渣分析等方法，但由于樣本污染、操作不當等多種原因，上述檢測方法均存在一定的假陽性和假陰性現象，且缺乏檢測特異性。此外，測流免疫層析技術(lateral?flow?chromatographic?assay，lfca)、流式細胞術(flowcytometry，fcm)等也被用于菌尿的即時篩選，節約了實驗成本，縮短了檢測時間，可實現敏感快速的檢測；但lfca仍需要多中心前瞻性研究鑒定其精準度，而fcm僅篩查菌尿，不能進行病原體鑒定及藥敏試驗。
3、近年來，隨著分子生物學技術的發展，maldi-tof質譜、熒光原位雜交(fluorescence?in?situ?hybridization，fish)和聚合酶鏈反應(polymerase?chainreaction，pcr)以及基因芯片技術也被用于尿路感染病原菌的診斷，但上述方法成本較高、樣本前處理復雜、
4、經基因工程得到的報告噬菌體在細菌鑒定方面極具應用潛力。針對噬菌體的基因工程技術包括傳統的同源重組技術、λ-red重組、電轉化dna的噬菌體重組(bacteriophagerecombineering?of?electroporated?dna，bred)，以及近年來新發展的體外合成重啟技術、crispr/cas系統介導的基因編輯技術等。其中，傳統的同源重組和λ-red重組技術存在重組效率低(約1％)、缺乏重組體篩選標記而篩選困難等問題。bred技術將重組效率提高到10％～15％，但該技術依賴于轉化效率較高的宿主感受態細胞。體外合成重啟技術有效提高了工程噬菌體的產生效率，但該過程依賴于宿主菌的成功轉化，且對于基因組過大的噬菌體工程化仍舊有難度。而crispr/cas系統則顯著提高了基因編輯的效率和準確性。其中，crispr/cas9系統極具應用潛力，已成為工程化原核系統和真核系統的有力工具，為此我們提出了一種基于噬菌體的尿路感染快速精準檢測方法。
技術實現思路
1、針對現有技術的不足，本專利技術提供了一種基于噬菌體的尿路感染快速精準檢測方法，解決了上述的問題。
2、為實現上述所述目的，本專利技術提供如下技術方案：一種基于噬菌體的尿路感染快速精準檢測方法，包括以下步驟：
3、s1：構建crispr/cas9系統，首先構建正確的pcrispr-cr6質粒，將pcas9質粒、pcrispr-cr6質粒依次轉化大腸桿菌bl21感受態細胞，并進行菌落pcr驗證質粒轉化成功，得到pcas9-pcrispr-cr6-bl21，即crispr/cas9系統構建成功；
4、s2：構建同源重組質粒，選取soc基因的上游1041bp、下游1000bp序列作為上下游同源臂，pcr擴增上下游同源臂及nanoluc基因區片段，將上游1041bp同源臂序列、nluc基因區和下游1000bp序列按順序整合至pce-zero線性化質粒上，構建環形同源重組質粒；
5、s3：構建三質粒bl21，首先得到pcas9-pcrispr-cr6-bl21感受態細胞，之后將同源重組質粒轉化pcas9-pcrispr-cr6-bl21感受態細胞，得到含有同源重組質粒、pcas9質粒和pcrispr-cr6質粒的三質粒bl21；
6、s4：構建、篩選并驗證報告噬菌體t4::nluc，首先通過雙層瓊脂平板法，使t4噬菌體感染三質粒bl21，制作pcr的模板進行pcr及瓊脂糖凝膠電泳，pcr反應程序同前，同時設置t4噬菌體為模板的對照組，篩選重組成功的t4::nluc，將pcr驗證成功的t4::nluc進一步進行sanger測序，確保t4::nluc構建成功；
7、s5：評估t4::nluc的檢測性能，包括評估t4::nluc的檢測限、t4::nluc的臨床菌株檢測覆蓋率、t4::nluc的檢測特異性和尿液基質對t4::nluc檢測性能的影響。
8、優選的，所述s1中構建crispr/cas9系統具體包括：在crispr/cas9系統中，sgrna的選擇也是基因編輯效率的一個主要速率限制因素，首先從crrna文庫選取針對t4非必需基因soc的切割效率較高的crrna——soc-cr6，在該序列的兩端添加bsai的酶切位點序列，磷酸化并退火為dna雙鏈，作為待使用的sgrna；
9、利用bsai酶在37℃條件下過夜酶切消化pcrispr環形質粒，并通過瓊脂糖凝膠電泳確認酶切是否成功，將cr6與得到的pcrispr線性化質粒通過t4?dna連接酶于4℃過夜連接，連接產物轉化大腸桿菌bl21感受態細胞，并涂布于含有終濃度為50μg/ml卡那霉素的固體lb瓊脂平板上，37℃過夜培養，挑取培養后的單克隆菌落進行菌落pcr，并進行sanger測序，確保pcrispr-cr6質粒構建正確，其中pcr反應程序：95℃預變性3min，95℃變性15s，58℃退火15s，72℃延伸40s，35個循環后，72℃終延伸5min，降至4℃保存；
10、將驗證正確的pcrispr-cr6-bl21過夜培養，通過fastpure?plasmid?mini?kit提取pcrispr-cr6質粒，置于-20℃備用；
11、將pcas9質粒、pcrispr-cr6質粒依次轉化大腸桿菌bl21感受態細胞，并進行菌落pcr驗證質粒轉化成功，pcr反應程序同前，得到pcas9-pcrispr-cr6-bl21，即crispr/cas9系統構建成功。
12、優選的，所述s2中構建同源重組質粒具體包括：選取soc基因的上游1041bp、下游1000bp序列作為上下游同源臂，針對上游同源臂序列、nanoluc(nluc)基因區和下游同源臂序列，分別設計兩端含有20本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種基于噬菌體的尿路感染快速精準檢測方法，其特征在于：包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的一種基于噬菌體的尿路感染快速精準檢測方法，其特征在于：所述S1中構建CRISPR/Cas9系統具體包括：在CRISPR/Cas9系統中，sgRNA的選擇也是基因編輯效率的一個主要速率限制因素，首先從crRNA文庫選取針對T4非必需基因soc的切割效率較高的crRNA——soc-cr6，在該序列的兩端添加BsaI的酶切位點序列，磷酸化并退火為DNA雙鏈，作為待使用的sgRNA；
3.根據權利要求2所述的一種基于噬菌體的尿路感染快速精準檢測方法，其特征在于：所述S2中構建同源重組質粒具體包括：選取soc基因的上游1041bp、下游1000bp序列作為上下游同源臂，針對上游同源臂序列、Nanoluc(Nluc)基因區和下游同源臂序列，分別設計兩端含有20bp序列重疊的引物UHA-F、UHA-R、Nluc-F、Nluc-R、DHA-F、DHA-R；
4.根據權利要求3所述的一種基于噬菌體的尿路感染快速精準檢測方法，其特征在于：所述S3中構建三質粒BL21具
5.根據權利要求4所述的一種基于噬菌體的尿路感染快速精準檢測方法，其特征在于：所述S4中構建、篩選并驗證報告噬菌體T4::Nluc具體包括：通過雙層瓊脂平板法，使T4噬菌體感染三質粒BL21，即將200μL對數期的三質粒BL21與100μL適當效價的T4噬菌體混勻，室溫放置15min，加至55℃熔融的0.625％的半固體LB瓊脂中，混勻并立即傾倒在固體LB平板上，凝固后，置于37℃溫箱培養過夜；
6.根據權利要求5所述的一種基于噬菌體的尿路感染快速精準檢測方法，其特征在于：所述S5中評估T4::Nluc的檢測限具體包括：將BL21大腸桿菌過夜培養后進行菌落計數，10倍系列稀釋為濃度為1×101CFU/mL～1×106CFU/mL的菌液，與適量T4::Nluc混勻，使得其終濃度為3×106PFU/mL，于37℃，200rpm搖床上共培養7h，期間，每10min取出50μL共培養液，加入20μL的Nluc反應底物，室溫孵育3min，多功能酶標儀測定發光值，并以時間為橫軸，發光值為縱軸，繪制不同菌濃度組的時間-發光曲線，其中閾值＝平均背景發光值加三倍標準差(SD)，檢測限為產生高于閾值的發光信號所需的最低菌濃度。
7.根據權利要求5所述的一種基于噬菌體的尿路感染快速精準檢測方法，其特征在于：所述S5中評估T4::Nluc的臨床菌株檢測覆蓋率具體包括：分別采用雙層瓊脂平板點滴法和發光測定法，測定T4::Nluc在104株臨床尿液分離的大腸桿菌中的檢測覆蓋率；
8.根據權利要求5所述的一種基于噬菌體的尿路感染快速精準檢測方法，其特征在于：所述S5中評估T4::Nluc的檢測特異性具體包括：將BL21(陽性對照)以及從臨床尿液中分離的糞腸球菌、屎腸球菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和人葡萄球菌各1株，于37℃，200rpm搖床過夜培養后，與適量T4::Nluc混合，繼續共培養5h，期間每10min取出50μL共培養液，加入20μL底物，室溫孵育3min后，測定發光值，繪制時間-發光曲線，同時設置僅T4::Nluc培養液組為陰性對照，若T4::Nluc僅與BL21大腸桿菌共培養后產生可檢測的發光信號，與其他幾種常見尿路感染病原菌共培養后未產生可檢測的發光信號，即T4::Nluc不識別裂解其他幾種病原菌，不存在交叉反應，具有極高的檢測特異性。
9.根據權利要求5所述的一種基于噬菌體的尿路感染快速精準檢測方法，其特征在于：所述S5中評估尿液基質對T4::Nluc檢測性能的影響具體包括：從臨床收集健康人的清潔中段尿，利用0.22μm細菌濾器過濾除菌，將過濾后的尿液加入大腸桿菌菌液中，使得各組尿液基質的比例分別為0％、20％、40％、60％、80％、100％，同時保證各組大腸桿菌濃度一致(2.72×107CFU/mL)，另外設置僅LB液體培養基組和僅尿液組，向上述各組加入適量T...
【技術特征摘要】
1.一種基于噬菌體的尿路感染快速精準檢測方法，其特征在于：包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的一種基于噬菌體的尿路感染快速精準檢測方法，其特征在于：所述s1中構建crispr/cas9系統具體包括：在crispr/cas9系統中，sgrna的選擇也是基因編輯效率的一個主要速率限制因素，首先從crrna文庫選取針對t4非必需基因soc的切割效率較高的crrna——soc-cr6，在該序列的兩端添加bsai的酶切位點序列，磷酸化并退火為dna雙鏈，作為待使用的sgrna；
3.根據權利要求2所述的一種基于噬菌體的尿路感染快速精準檢測方法，其特征在于：所述s2中構建同源重組質粒具體包括：選取soc基因的上游1041bp、下游1000bp序列作為上下游同源臂，針對上游同源臂序列、nanoluc(nluc)基因區和下游同源臂序列，分別設計兩端含有20bp序列重疊的引物uha-f、uha-r、nluc-f、nluc-r、dha-f、dha-r；
4.根據權利要求3所述的一種基于噬菌體的尿路感染快速精準檢測方法，其特征在于：所述s3中構建三質粒bl21具體包括：利用0.1mol/l的氯化鈣溶液，將pcas9-pcrispr-cr6-bl21制備為感受態細胞，將pcas9-pcrispr-cr6-bl21于37℃，200rpm搖床，培養至對數期，冰浴10min后4℃，4000rpm離心10min，棄去上清，加入等體積的4℃預冷的0.1mol/l的氯化鈣溶液重懸沉淀，冰浴30min，再次4℃，4000rpm離心10min，棄去上清，加入適量4℃預冷的0.1mol/l的氯化鈣溶液重懸沉淀，得到pcas9-pcrispr-cr6-bl21感受態細胞；
5.根據權利要求4所述的一種基于噬菌體的尿路感染快速精準檢測方法，其特征在于：所述s4中構建、篩選并驗證報告噬菌體t4::nluc具體包括：通過雙層瓊脂平板法，使t4噬菌體感染三質粒bl21，即將200μl對數期的三質粒bl21與100μl適當效價的t4噬菌體混勻，室溫放置15min，加至55℃熔融的0.625％的半固體lb瓊脂中，混勻并立即傾倒在固體lb平板上，凝固后，置于37℃溫箱培養過夜；
6.根據權利要求5所述的一種基于噬菌體的尿路感染快速精準檢測方法，其特征在于：所述s5中評估t4::nluc的檢測限具體包括：將bl21大腸桿菌過夜培養后進行...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王馳，王成彬，郝治云，李綿洋，李民偉，
申請(專利權)人：中國人民解放軍總醫院第一醫學中心，
類型：發明
國別省市：
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