【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物基因工程，具體涉及一種3d蛋白突變的a型塞內卡重組病毒株及其構建與應用。
技術介紹
1、豬塞內卡病毒病是由塞內卡病毒a(senecavirus?a，sva)感染引起豬的新發傳染病。該病毒也稱a型塞內卡毒、塞內卡谷病毒(seneca?valley?virus?a，svv)，屬于小rna病毒科(picornaviridae)、塞內卡病毒屬(senecavirus)的唯一成員。sva主要通過接觸傳播，可引起豬的口腔黏膜、鼻鏡、蹄部冠狀帶水皰樣病變，在臨床上與口蹄疫(foot?and?mouthdisease，fmd)、豬水皰病(swine?vesicular?disease，svd)和水皰性口炎(vesicularstomatitis，vs)等疫病難以區分。2022年，我國農業農村部將該病列入《一、二、三類動物疫病病種名錄》中的三類動物疫病病種。
2、sva是無囊膜的單鏈正義ran病毒，其病毒粒子呈二十面體對稱，直徑約為27nm。sva基因組全長約7.3kb，病毒基因組包括5’非編碼區(untranslated?region,utr)、3’-utr和一個開放閱讀框(orf)。其中，orf編碼約2180個氨基酸的多聚蛋白，該多聚蛋白被病毒和宿主蛋白酶切割成四種結構蛋白(vp1、vp2、vp3和vp4)和八種非結構蛋白(l、2a、2b、2c、3a、3b、3c和3d)。病毒衣殼由60個原聚體緊密排列構成，每個原聚體由四種結構蛋白組成。結構蛋白vps構成病毒衣殼并參與病毒吸附等過程，非結構蛋白在病毒復制中發揮主要
3、近些年，sva感染已成為我國流行的一種以口鼻部和蹄冠部水皰狀病變為主的病毒性疫病，臨床上的鑒別診斷往往將其與fmd、svd或vs混淆。嚴重的情況下，sva感染會導致新生仔豬的急性死亡。病毒基因組頻繁存在變異和重組現象，目前尚無商品化疫苗用于防控，也沒有效的抗sva靶向藥物。相關試驗報道表明各種候選疫苗，如減毒活疫苗、滅活疫苗、亞單位疫苗、核酸疫苗、病毒樣顆粒疫苗和重組病毒活載體疫苗，對預防斷奶仔豬、生長豬和育肥豬感染sva有效。但對于這些疫苗臨床保護的安全性及持久性，后續還需更多的數據進行驗證。盡管生物安全防控可保護豬群免受sva的侵害，但接種疫苗仍是預防和控制sva最直接、有效的手段。迄今為止，國內外仍無sva商品化疫苗可供使用，可能歸因于sva致病機制相關的研究還不夠明確，再加之sva基因組易發生重組和突變，使防控工作依然面臨巨大挑戰。
4、含自由基s-腺苷甲硫氨酸結構域蛋白1(rsad1)是來自大腸桿菌的hemw具有序列同源性(26％的同一性和45％的相似性)。hemw是一種參與血紅素合成的不依賴氧的糞卟啉原iii氧化酶。hemw包含一個結合[4fe-4s]簇的sam結構域。其中，sam結構域對于hemw發揮催化作用是必須的。hemw催化血紅素轉移依賴于與[4fe-4s]簇的結合。哺乳動物rsad1也包含一個保守的sam結構域，該區域中存在一個cxxxcxxc基序，負責結合[4fe-4s]簇。目前，rsad1是否具有修飾蛋白底物的酶活性一直沒有報道。研究表明，rsad1是一種能夠通過sam結構域穩定結合血紅素，從而介導血紅素插入呼吸鏈酶的分子伴侶。rsad1在脊椎動物中高度保守，這表明它可能在生物體中具有非常重要的功能。rsad1基因位于17號染色體上髓過氧化物酶慢性粘附蛋白基因組區間中，該基因區間已被證明對心臟發育很重要。rsad1在成人心臟組織和許多胎兒器官的線粒體膜中高度表達，這表明它有可能在心臟發育中發揮重要作用。
技術實現思路
1、針對上述技術問題，本專利技術首先發現下調表達rsad1能夠顯著抑制sva的復制，rsad1可作為靶點用于篩選抑制a型塞內卡病毒的藥物；其次，本專利技術發現sva?3d蛋白的第398位氨基酸是甲硫氨酸氧化修飾的關鍵位點，將3d蛋白的第398位氨基酸突變為a后，影響了3d蛋白的穩定性；最后，本專利技術將3d蛋白的第398位氨基酸突變為a構建并成功拯救獲得了塞內卡病毒3d的甲硫氨酸氧化修飾位點突變的塞內卡重組病毒株rsva-3dm398a，與野生型sva相比，rsva-3dm398a的毒價顯著降低，毒力降低，可作為重組疫苗株，具有廣泛的應用價值。具體包括以下內容：
2、第一方面，本專利技術提供了rsad1蛋白為靶點在篩選抑制a型塞內卡病毒的藥物中的應用，所述藥物抑制或下調rsad1蛋白的表達。
3、優選地，所述藥物為小干擾rna。
4、優選地，所述小干擾rna選自：
5、rsad1-rnai#1：gcaacuucaacaaguacautt；
6、或rsad1-rnai#2：gggcgcuuaguacccacaatt。
7、第二方面，本專利技術提供了通過將a型塞內卡病毒3d蛋白的第398位甲硫氨酸突變為丙氨酸制備減毒的a型塞內卡病毒重組病毒株中的應用。
8、優選地，所述a型塞內卡病毒為a/fj/cha/2017株。
9、第三方面，本專利技術提供了一種a型塞內卡重組病毒株所述a型塞內卡重組病毒株為將親本a型塞內卡病毒中3d蛋白的第398位甲硫氨酸突變為丙氨酸。
10、優選地，所述a型塞內卡病毒為a/fj/cha/2017株。
11、第四方面，本專利技術提供了上述第三方面所述的a型塞內卡重組病毒株在制備a型塞內卡病毒疫苗中的應用。
12、優選地，所述疫苗為減毒疫苗。
13、第五方面，本專利技術提供了上述第三方面所述的a型塞內卡重組病毒株的制備方法，所述方法為：通過基因工程手段使親本a型塞內卡病毒3d蛋白的第398位甲硫氨酸突變為丙氨酸。
14、優選地，所述方法包括以下步驟：
15、(1)以親本a型塞內卡病毒a/fj/cha/2017株的重組質粒為模板，利用定點突變pcr方法，將a/fj/cha/2017株3d蛋白的第398位甲硫氨酸突變為丙氨酸，構建重組質粒rsva-3dm398a；
16、(2)將重組質粒rsva-3dm398a轉染ibrs-2細胞，病毒拯救獲得a型塞內卡重組病毒株。
17、優選地，所述重組質粒中含3d?m398a點突變基因序列如seq?id?no.1所示。
18、優選地，所述病毒拯救具體方法為：
19、(1)提前16h將ibrs-2細胞接種于t25培養瓶中；
20、(2)在干凈的ep管中加入適量trans?bufffer，將重組質粒rsva-3dm398a加入ep管中，質粒與轉染試劑的比例為1μg：2μl，輕輕吹打混勻靜置10min；待細胞生長至70％–80％，使用polyplus轉染試劑將重組質粒轉入細胞；
21、(3)將細胞瓶中的原培養基棄掉，更換新的dmem細胞培養基；
22、(4)將混合液加入本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.RSAD1蛋白為靶點在篩選抑制A型塞內卡病毒的藥物中的應用，其特征在于，所述藥物抑制或下調RSAD1蛋白的表達。
2.如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述藥物為小干擾RNA。
3.如權利要求2所述的應用，其特征在于，所述小干擾RNA選自：
4.通過將A型塞內卡病毒3D蛋白的第398位甲硫氨酸突變為丙氨酸制備減毒的A型塞內卡病毒重組病毒株中的應用。
5.如權利要求4所述的應用，其特征在于，所述A型塞內卡病毒為A/FJ/CHA/2017株。
6.一種A型塞內卡重組病毒株，其特征在于，所述A型塞內卡重組病毒株為將親本A型塞內卡病毒中3D蛋白的第398位甲硫氨酸突變為丙氨酸。
7.如權利要求6所述的A型塞內卡重組病毒株，其特征在于，所述A型塞內卡病毒為A/FJ/CHA/2017株。
8.如權利要求6或7所述的A型塞內卡重組病毒株在制備A型塞內卡病毒減毒疫苗中的應用。
9.如權利要求6或7所述的A型塞內卡重組病毒株的制備方法，其特征在于，所述方法為：通過基因工程手段使親本A型塞內卡病毒3
10.如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：
...【技術特征摘要】
1.rsad1蛋白為靶點在篩選抑制a型塞內卡病毒的藥物中的應用，其特征在于，所述藥物抑制或下調rsad1蛋白的表達。
2.如權利要求1所述的應用，其特征在于，所述藥物為小干擾rna。
3.如權利要求2所述的應用，其特征在于，所述小干擾rna選自：
4.通過將a型塞內卡病毒3d蛋白的第398位甲硫氨酸突變為丙氨酸制備減毒的a型塞內卡病毒重組病毒株中的應用。
5.如權利要求4所述的應用，其特征在于，所述a型塞內卡病毒為a/fj/cha/2017株。
6.一種a型塞內卡重組病毒株，其特征在于，所述...
【專利技術屬性】
技術研發人員：鄭海學，郝榮增，李偉偉，茹毅，范許許，馬坤，王姿逸，朱兆宇，
申請(專利權)人：中國農業科學院蘭州獸醫研究所中國動物衛生與流行病學中心蘭州分中心，
類型：發明
國別省市：
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