【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于細胞工程，尤其是一種即時使用的通用型nk細胞冷凍制劑及其制備方法與使用方法。
技術介紹
1、nk細胞(natural?kill?cells)一種天然免疫系統的效應細胞，它無需抗原預先致敏即可識別腫瘤及病毒感染的細胞，在機體的免疫監視和免疫防御過程中發揮著關鍵效應。nk細胞通過多種機制參與抗腫瘤免疫反應：nk細胞表面受體cd16通過adcc效應殺傷腫瘤細胞；nk細胞可釋放穿孔素、顆粒酶激活凋亡系統攻擊腫瘤細胞；nk細胞能夠表達死亡配體(fasl)結合靶細胞死亡受體(fas)引起靶細胞凋亡；活化的nk細胞能分泌多種細胞因子，如tnf、粒細胞－巨噬細胞集落刺激因子、il-15、il-10、il-13等細胞因子來抑制腫瘤細胞的增殖以及殺傷腫瘤細胞。
2、nk細胞應用主要包括自體nk細胞和異體nk細胞兩種形式，大量臨床實驗證明，自體nk細胞治療在腫瘤治療中雖有一定的治療效果，且無明顯毒副作用，但隨著年齡的增長，人體內的nk細胞數量會逐漸減少，活性也會降低，尤其對老年人或免疫力低下的患者來說，可能無法滿足治療需求，且自體nk的制備過程需要經過分離擴增步驟，耗時較長，對于緊急治療的患者來說，可能不是最佳選擇。異體nk細胞臨床應用的主要形式為新鮮制劑，雖然新鮮制劑的細胞活性更高，但因其活細胞的特性造成其有效期短(一般為24小時)、無法即時使用且存在產品檢測結果滯后等問題，因此研究一種能夠批量制備、即時使用、檢測無滯后的異體nk細胞冷凍制劑庫迫在眉睫。
技術實現思路
1、針
2、本專利技術解決其技術問題才采用的具體技術方案是：一種即時使用的通用型nk細胞冷凍制劑的制備方法，包括以下步驟：
3、(1)將臍血單個核細胞通過體外滋養層刺激擴增后制備的nk種子庫細胞進行凍存，將種子庫復蘇后以滋養層細胞進行大規模二次擴增，以400-600g離心力離心10-15分鐘，棄上清，加入含體積份數0.2％-0.4％人血白蛋白的氯化鈉注射液的洗液清洗，最終獲得的細胞活率不低于95％；
4、(2)以質量體積比濃度20％的人血白蛋白重懸細胞沉淀，根據計數結果調整細胞濃度，細胞懸液和凍存保護液按照體積比2:1的比例混合均勻，分灌至凍存管中，放入醫用低溫冰箱中，并隨機抽取一管細胞送檢，檢測符合質量標準后，24h后將冷凍制劑轉入氣相液氮罐中長期保存，制得即時使用的通用型nk細胞冷凍制劑；
5、所述凍存保護液的配制：質量體積比20％人血白蛋白和dmso按照體積比7:3的比例配制，冷藏保存。
6、進一步，步驟(2)中，調整細胞濃度為7.5×107/ml。
7、進一步，分灌裝至5ml凍存管，凍存規格為每管4ml、細胞終濃度為5×107/ml。
8、進一步，步驟(2)中，細胞送檢的檢測包括：細胞總數、活率、需/厭氧菌、真菌、支原體、內毒素、表面標志物。
9、上述的制備方法得到的即時使用的通用型nk細胞冷凍制劑。
10、上述的即時使用的通用型nk細胞冷凍制劑的使用方法，按照制劑規格，使用金屬浴或者水浴復蘇通用型nk細胞冷凍制劑，直接用于臨床研究或動物實驗。
11、本專利技術的優點和技術效果：本專利技術分離臍帶血獲得單個核細胞，通過體外誘導培養獲得nk細胞的種子庫并凍存。復蘇種子庫細胞進行二次大規模擴增培養，得到純度大于90％的nk細胞制劑，經過多次清洗后去除培養體系中的殘留，然后以人血白蛋白重懸細胞并加入凍存保護液，分裝凍存得到nk細胞冷凍制劑庫，凍存細胞總量可達到1011數量級，并對庫存細胞進行完善的細胞活性、純度、微生物及內毒素等檢測。將nk細胞冷凍制劑復蘇，即可得到純度高、質量優的即用型nk細胞制劑，本專利技術無需患者提供種子細胞，減少患者痛苦；即時使用，檢測無滯后，可為臨床研究、動物實驗、疾病患者等更方便快速的提供所需的nk細胞；nk細胞制劑純度高，批次間細胞品質穩定可控。
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1.一種即時使用的通用型NK細胞冷凍制劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述即時使用的通用型NK細胞冷凍制劑的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，調整細胞濃度為7.5×107/ml。
3.根據權利要求2所述即時使用的通用型NK細胞冷凍制劑的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，分灌裝至5ml凍存管，凍存規格為每管4ml、細胞終濃度為5×107/ml。
4.根據權利要求1所述即時使用的通用型NK細胞冷凍制劑的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，細胞送檢的檢測包括：細胞總數、活率、需/厭氧菌、真菌、支原體、內毒素、表面標志物。
5.如權利要求1-4任一項所述的制備方法得到的即時使用的通用型NK細胞冷凍制劑。
6.如權利要求5所述的即時使用的通用型NK細胞冷凍制劑的使用方法，其特征在于，按照制劑規格，使用金屬浴或者水浴復蘇通用型NK細胞冷凍制劑，直接用于臨床研究或動物實驗。
【技術特征摘要】
1.一種即時使用的通用型nk細胞冷凍制劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述即時使用的通用型nk細胞冷凍制劑的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，調整細胞濃度為7.5×107/ml。
3.根據權利要求2所述即時使用的通用型nk細胞冷凍制劑的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，分灌裝至5ml凍存管，凍存規格為每管4ml、細胞終濃度為5×107/ml。
4.根據權利要求1...
【專利技術屬性】
技術研發人員：李星怡，韓顥，胡學鑫，韓洪起，王欣言，孫超凡，
申請(專利權)人：優賽生命科學發展有限公司，
類型：發明
國別省市：
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