【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于生物檢測，具體涉及一種檢測猴水痘病毒的引物和探針組合及其應用。
技術(shù)介紹
1、大部分生物藥(如單克隆抗體)以注射方式應用于疾病治療，這些生物藥的質(zhì)量與患者的用藥安全密切相關(guān)。各國監(jiān)管機構(gòu)出臺了一系列法規(guī)來確保生物藥的生物安全性，如法規(guī)中明確要求對生產(chǎn)用種子庫細胞，對細胞培養(yǎng)結(jié)束時混懸液，動物組織原材料勻漿做病毒檢測，即采用各種適宜的方法檢測污染的病毒。
2、生物制品的出現(xiàn)對人類的健康和生活質(zhì)量的提高有非常特殊的意義。大量恒河猴腎細胞(llc-mk2)，非洲綠猴腎細胞(vero)在疫苗生產(chǎn)中被大量使用，其質(zhì)量直接影響生物制品的質(zhì)量安全，特別是病毒類生物活性物質(zhì)污染會嚴重影響制品的質(zhì)量安全。同時，llc-mk2和vero作為人源、靈長類病毒感染指示細胞之一，在細胞系病毒感染篩查實驗中大量使用。目前很多病毒疫苗類生物制品以猴源作為表達宿主。因此，生物安全檢測機構(gòu)需要開發(fā)一種方便、快捷、靈敏、特異性強的檢測病毒的方法。
3、猴水痘病毒(simian?varicella?virus，svv)是一種靈長類皰疹病毒，與水痘(chickenpox)和帶狀皰疹(shingles)的病原體水痘-帶狀皰疹病毒(varicella-zostervirus，vzv)密切相關(guān)。svv可在非洲綠猴細胞(vero、bsc-1或cv-1)中體外繁殖。在細胞單層裂解感染期間，病毒誘導細胞病變效應(cpe)，包括變圓、腫脹和融合的多核細胞。其中，恒河猴經(jīng)常被用于生物醫(yī)學實驗。這些非人靈長類動物在生物制品的研究與開發(fā)過程中，作為一
4、目前，指導原則中推薦的用于生物安全檢測的病毒檢測方法包含了體外法、體內(nèi)法、動物抗體產(chǎn)生試驗、電鏡、elisa、pcr或rt檢測等。其中，體外法采用敏感細胞系進行共培養(yǎng)檢測，在適宜的培養(yǎng)時間點(通常為28天)取樣檢測感染性病毒。在沒有可靠的體外試驗方法時，可采用適宜動物進行接種盲傳試驗，采用體內(nèi)法檢測有無感染性病毒。對于尚沒有合適的體內(nèi)和體外病毒檢測方法時，可采用不同的動物，觀察種特異病毒的抗體產(chǎn)生情況。以上方法由于檢測周期較長，實驗操作繁瑣，實驗動物倫理等原因，在一定程度上限制了其應用范圍。核酸檢測技術(shù)檢測周期短，操作便利，無需動物，因此適用范圍較廣，且靈敏度較高，檢測周期短，是svv病毒檢測的一種較好的選擇。
5、聚合酶鏈式反應(pcr)是檢測目標核酸片斷的有力工具，pcr通過熱循環(huán)驅(qū)動擴增。從1981年專利技術(shù)該技術(shù)以來，多種改進程序被引入以滿足分子生物學領(lǐng)域的科研需求。定量pcr(qpcr，q-pcr)被廣泛用于細胞中核酸的定量以及檢測目標蛋白的表達水平。該技術(shù)已被開發(fā)應用于病毒檢測以及病毒清除研究。qpcr主要的方法學是通過實時監(jiān)測熒光強度來檢測pcr產(chǎn)物的含量。而在常規(guī)pcr中，擴增產(chǎn)物通過電泳進行分離和可視化。qpcr中使用的dna聚合酶具有5’至3’的核酸內(nèi)切酶活性，通過水解標記有熒光素和淬滅染料的寡核苷酸探針，產(chǎn)生熒光信號。將qpcr和熒光素標記探針相結(jié)合，理論上可以檢測單個病毒dna/rna，在實際應用中qpcr可以檢測到樣品中個位數(shù)的病毒dna/rna，無論病毒的活性如何。
6、目前，將qpcr用于外源性因子檢測的例子是進行外源病毒因子檢測，例如檢測一些用于生產(chǎn)生物制品的工程細胞系的主細胞庫(mbc)，工作細胞庫(wbc)是否存在特定的病毒。中國藥典規(guī)定，針對人源細胞系，應考慮檢測人eb病毒、人巨細胞病毒(hcmv)、人逆轉(zhuǎn)錄(hiv-1/2，htlv1/2)、人肝炎病毒(hav，hbv，hcv)、人細小病毒b19、人乳頭瘤病毒、人多瘤病毒、難培養(yǎng)的人腺病毒和人皰疹病毒-6/7/8等。另外，2020版中國藥典增加了pcr(qpcr)檢查方法。因此，建立一種具有良好專一性、靈敏性以及變異株高度覆蓋性等優(yōu)點的檢測猴水痘病毒的方法具有重要的應用價值。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本專利技術(shù)的目的在于提供一種檢測猴水痘病毒的引物和探針組合及其應用。本專利技術(shù)針對所有不同類型猴水痘病毒svv，設(shè)計對應的正反向引物、探針以及反應程序，建立一種具有良好專一性、靈敏性以及變異株高度覆蓋性等優(yōu)點的實時定量pcr法，且該檢測方法適用于生物制品大批量生產(chǎn)的繁復檢測。
2、為達到此專利技術(shù)目的，本專利技術(shù)采用以下技術(shù)方案：
3、第一方面，本專利技術(shù)提供一種檢測猴水痘病毒的引物和探針組合，所述引物特異性擴增猴水痘病毒orfa基因，所述探針特異性結(jié)合猴水痘病毒orfa基因；
4、所述引物包括seq?id?no:1所示的正向引物和seq?id?no:2所示的反向引物；所述探針的核苷酸序列包括seq?id?no:3所示。
5、seq?id?no:1：gactatacacccggggcatg。
6、seq?id?no:2：tgcacatactctggccagc。
7、seq?id?no:3：tgaggccggcgtgttgggggcgctaat。
8、猴水痘svv和人水痘vzv的基因序列相近，本專利技術(shù)采用猴水痘特有的orf?a作為靶點，可以讓檢測更具有特異性。
9、本專利技術(shù)中，通過對ncbi數(shù)據(jù)庫中svv完整全基因組(nc_002686和af275348)，設(shè)計出1組實時定量pcr的正反向引物以及探針，所述引物和探針組合能夠高效、準確地檢測出所有類型的svv?dna，并且不受大量背景細胞dna的影響，特別適用于檢測生物制藥原料和產(chǎn)品，尤其是細胞庫中的svv病毒污染。
10、本專利技術(shù)中，通過ncbi找到所有svv的病毒序列，并使用比對軟件megax，clustalw算法比對，本專利技術(shù)設(shè)計的引物探針可以完美結(jié)合到上述序列，進一步說明本引物探針可以檢測出所有類型的svv。
11、優(yōu)選地，所述探針的5’端修飾熒光素，所述探針的3’端修飾淬滅劑。
12、優(yōu)選地，所述熒光素選自fam、vic或hex任意一種。
13、優(yōu)選地，所述淬滅劑選自mgb、bhq1或tamra任意一種。
14、在現(xiàn)有的病毒檢測方法中，將qpcr技術(shù)應用于病毒檢測的主要障礙包括：樣品基質(zhì)產(chǎn)生假陽性信號；檢測靈敏度不夠高；樣品基質(zhì)抑制pcr反應。對于假陽性號：通過本專利技術(shù)的實驗可以看出，使用本專利技術(shù)設(shè)計的引物探針，檢測無模板樣品和未摻入病毒序列的宿主，都無法檢測出猴水痘病毒。說明本專利技術(shù)的檢測不會產(chǎn)生非特異性擴增，本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
1.一種檢測猴水痘病毒的引物和探針組合，其特征在于，所述引物特異性擴增猴水痘病毒ORFA基因，所述探針特異性結(jié)合猴水痘病毒ORFA基因；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測猴水痘病毒的引物和探針組合，其特征在于，所述探針的5’端修飾熒光素，所述探針的3’端修飾淬滅劑；
3.一種檢測猴水痘病毒的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權(quán)利要求1或2所述的檢測猴水痘病毒的引物和探針組合。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測猴水痘病毒的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括病毒核酸標準品和熒光定量PCR反應試劑；
5.權(quán)利要求3或4所述的檢測猴水痘病毒的試劑盒以非疾病診斷和/或治療為目的的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括以下步驟：
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的使用方法，其特征在于，所述熒光定量PCR體系中，引物的終濃度為800-900nM，探針的終濃度為220-250nM；
7.一種檢測猴水痘病毒的方法，其特征在于，所述方法包括：
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述熒光定量PCR體系中，引物的終濃度為800-
9.一種檢測猴水痘病毒的系統(tǒng)，其特征在于，所述系統(tǒng)包括：
10.權(quán)利要求1或2所述的檢測檢測猴水痘病毒的引物和探針組合、權(quán)利要求3或4所述的檢測猴水痘病毒的試劑盒或權(quán)利要求9所述的檢測猴水痘病毒的系統(tǒng)中的任意一種或至少兩種的組合在制備檢測猴水痘病毒的產(chǎn)品中的應用。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種檢測猴水痘病毒的引物和探針組合，其特征在于，所述引物特異性擴增猴水痘病毒orfa基因，所述探針特異性結(jié)合猴水痘病毒orfa基因；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測猴水痘病毒的引物和探針組合，其特征在于，所述探針的5’端修飾熒光素，所述探針的3’端修飾淬滅劑；
3.一種檢測猴水痘病毒的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權(quán)利要求1或2所述的檢測猴水痘病毒的引物和探針組合。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測猴水痘病毒的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括病毒核酸標準品和熒光定量pcr反應試劑；
5.權(quán)利要求3或4所述的檢測猴水痘病毒的試劑盒以非疾病診斷和/或治療為目的的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括以下步驟：...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：龔圓昊，董元舒，童涌，
申請(專利權(quán))人：蘇州藥明檢測檢驗有限責任公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
還沒有人留言評論。發(fā)表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。