【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物技術與診斷檢測、鑒定，特別涉及于一種錐體蟲的sybr?greenⅰ實時熒光定量pcr檢測引物及其試劑盒。
技術介紹
1、大黃魚錐體蟲病于2023年在寧德網箱養殖大黃魚首次發現，并在2024年迅速蔓延至整個大黃魚主養區，成為大黃魚最主要病害之一。病原為錐體蟲屬(trypanosoma)的錐體蟲，感染大黃魚后，引起大黃魚魚體表潰爛，發病魚死亡率達40％-70％，造成巨大的經濟損失。因此建立一種準確、快速、靈敏的檢測方法對其進行流行動態監測，保障大黃魚養殖業健康發展迫在眉睫。
2、目前對大黃魚錐體蟲的傳統檢測方法主要通過制作血涂片進行光學顯微鏡檢查。該方法的靈敏度和檢出率較低，需要人工對樣本進行細致的鏡檢觀察，難以實現大批量樣本的早期篩查。為此，本專利技術提出一種大黃魚錐體蟲的sybr?greenⅰ實時熒光定量pcr檢測引物及其試劑盒，以便解決上述存在的問題。
技術實現思路
1、(1)要解決的技術問題
2、本專利技術的目的在于提供一種錐體蟲的sybr?greenⅰ實時熒光定量pcr檢測引物；
3、本專利技術的另一目的在于提供一種錐體蟲的sybr?greenⅰ實時熒光定量pcr檢測試劑盒；
4、本專利技術的另一目的在于提供一種采用上述的pcr檢測引物的錐體蟲的sybrgreenⅰ實時熒光定量pcr檢測方法；
5、本專利技術的另一目的在于提供上述pcr檢測試劑盒在檢測魚類錐體蟲病中的應用。
6、本專利技
7、(2)技術方案
8、為了解決上述技術問題，本專利技術的第一個方面，提供：
9、一種錐體蟲的sybr?greenⅰ實時熒光定量pcr檢測引物，所述pcr檢測引物包括如seq?id?no.1所示的上游引物的核苷酸序列和如seq?id?no.2所示的下游引物的核苷酸序列。
10、區別于現有技術，上述技術方案提供了pcr特異性引物，對錐體蟲的18s?rrna進行sybr?greenⅰ法實時熒光定量擴增檢測，用于魚類的錐體蟲病，尤其是大黃魚錐體蟲病的快速鑒定。
11、進一步地，pcr擴增反應條件為：95℃預變性30s；95℃變性5s，62℃退火30s，共40個循環。
12、本專利技術的第二個方面，提供：
13、一種錐體蟲的sybr?greenⅰ實時熒光定量pcr檢測試劑盒，所述pcr檢測試劑盒包含本申請第一方面所述的述pcr檢測引物。
14、進一步地，所述pcr檢測試劑盒的擴增反應條件為：95℃預變性30s；95℃變性5s，62℃退火30s，共40個循環。
15、進一步地，所述pcr檢測試劑盒的擴增反應體系為tb?greenpremix?ex?taq?ii(tli?rnaseh?plus)10μl，上游引物0.4μl，下游引物0.4μl，模板2μl，補充滅菌去離子水至終體積20μl。
16、進一步地，所述上游引物、下游引物的濃度均為10μmol/l。
17、進一步地，所述pcr檢測試劑盒用于菌落pcr。
18、本專利技術的第三個方面，提供：
19、一種采用本申請第一方面所述的pcr檢測引物的錐體蟲的sybr?greenⅰ實時熒光定量pcr檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：
20、1)提取待測樣本基因組dna；
21、2)實時熒光定量pcr反應；
22、其中，實時熒光定量pcr擴增反應體系為：tb?green?premix?extaq?ii(tlirnaseh?plus)10μl，上游引物0.4μl，下游引物0.4μl，標準質粒或待測模板2μl，剩余為滅菌去離子水，反應體系的總體積為20μl；實時熒光定量pcr擴增反應條件為：95℃預變性30s；95℃變性5s，62℃退火30s，共40個循環；
23、3)結果判定：
24、若待測樣本核酸濃度高于檢測下限1.0×101拷貝/μl時，則判定為大黃魚錐體蟲陽性，反之則為陰性。
25、本專利技術的第四個方面，提供：
26、本申請第二方面所述pcr檢測試劑盒在檢測魚類錐體蟲病的用途。
27、進一步地，所述魚類包括大黃魚。
28、(3)有益效果
29、本專利技術的有益效果是：本專利技術首次建立了特異性檢測大黃魚錐體蟲的sybr?greenⅰ實時熒光定量pcr檢測引物及其試劑盒，解決了現有技術中缺乏針對大黃魚錐體蟲病的sybr?greenⅰ實時熒光定量pcr檢測方法。采用本專利技術的試劑盒，使用所述特異性引物，按所述方法即可實現大黃魚錐體蟲樣本快速、批量的定量檢測，檢測特異性強，靈敏度高。當前尚未見基于sybr?greenⅰ定量檢測大黃魚錐體的實時熒光定量pcr檢測方法的研究報道，本專利技術為大黃魚錐體感染的診斷提供依據，對保障大黃魚養殖業的發展起到重要作用，可靠性更強，具有很好的應用前景。
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1.一種錐體蟲的SYBR?GreenⅠ實時熒光定量PCR檢測引物，其特征在于，所述PCR檢測引物包括如SEQ?ID?NO.1所示的上游引物的核苷酸序列和如SEQ?ID?NO.2所示的下游引物的核苷酸序列。
2.根據權利要求1所述的錐體蟲的SYBR?GreenⅠ實時熒光定量PCR檢測引物，其特征在于，PCR擴增反應條件為：95℃預變性30s；95℃變性5s，62℃退火30s，共40個循環。
3.一種錐體蟲的SYBR?GreenⅠ實時熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述PCR檢測試劑盒包含權利要求1所述的述PCR檢測引物。
4.根據權利要求3所述的錐體蟲的SYBR?GreenⅠ實時熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述PCR檢測試劑盒的擴增反應條件為：95℃預變性30s；95℃變性5s，62℃退火30s，共40個循環。
5.根據權利要求3所述的錐體蟲的SYBR?GreenⅠ實時熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述PCR檢測試劑盒的擴增反應體系為TB?Green?Premix?Ex?Taq?II(Tli?RNaseHPlu
6.根據權利要求5所述的錐體蟲的SYBR?GreenⅠ實時熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述上游引物、下游引物的濃度均為10μmol/L。
7.根據權利要求3所述的錐體蟲的SYBR?GreenⅠ實時熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述PCR檢測試劑盒用于菌落PCR。
8.一種采用權利要求1或2所述的PCR檢測引物的錐體蟲的SYBR?GreenⅠ實時熒光定量PCR檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：
9.權利要求3-7任一所述的PCR檢測試劑盒在檢測魚類錐體蟲病的用途。
10.根據權利要求8所述的用途，其特征在于：所述魚類包括大黃魚。
...【技術特征摘要】
1.一種錐體蟲的sybr?greenⅰ實時熒光定量pcr檢測引物，其特征在于，所述pcr檢測引物包括如seq?id?no.1所示的上游引物的核苷酸序列和如seq?id?no.2所示的下游引物的核苷酸序列。
2.根據權利要求1所述的錐體蟲的sybr?greenⅰ實時熒光定量pcr檢測引物，其特征在于，pcr擴增反應條件為：95℃預變性30s；95℃變性5s，62℃退火30s，共40個循環。
3.一種錐體蟲的sybr?greenⅰ實時熒光定量pcr檢測試劑盒，其特征在于，所述pcr檢測試劑盒包含權利要求1所述的述pcr檢測引物。
4.根據權利要求3所述的錐體蟲的sybr?greenⅰ實時熒光定量pcr檢測試劑盒，其特征在于，所述pcr檢測試劑盒的擴增反應條件為：95℃預變性30s；95℃變性5s，62℃退火30s，共40個循環。
5.根據權利要求3所述的錐體蟲的sybr?greenⅰ實時熒光定量pc...
【專利技術屬性】
技術研發人員：池洪樹，龔暉，林能鋒，潘瀅，許斌福，
申請(專利權)人：福建省農業科學院生物技術研究所，
類型：發明
國別省市：
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