【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一組線粒體信號肽及其應用，屬于遺傳工程領域。
技術介紹
1、隨著合成生物學及代謝工程的快速發展，綠色、環保、可持續發展的微生物細胞工程構建成功引起了廣泛關注。盡管大多數工程代謝途徑位于酵母菌細胞質中，但將整個代謝途徑重定向到亞細胞細胞器的區室化工程也代表了一種具有吸引力的代謝工程策略。作為細胞動力源的線粒體通常被認為是最有前途的亞細胞細胞器區隔工程。重組線粒體整個代謝工程在利用豐富的前體庫(如丙酮酸鹽、乙酰輔酶a、atp、nadh和脂肪酰基輔酶a等)、更強的氧化還原微環境、繞過競爭途徑、最大限度減少運輸限制等方面具有重要優勢。為了實現線粒體區室化，需要n端線粒體靶向序列來將靶向酶重定位到線粒體中。據報道，重復使用相同的靶向序列將整個代謝通路基因靶向到線粒體，很容易導致通路基因不穩定或競爭問題。因此，為拓展線粒體區室化工程在多基因生物合成途徑中的應用，挖掘和篩選更高效的靶向序列具有重要意義。目前，線粒體區室化已在釀酒酵母中被證明可以提高一系列高附加值化合物的生產，如瓦倫烯、異丁醇、異戊二烯等。然而，在圓紅冬孢酵母(rhdotorulatoruloides)中尚未被表征具有線粒體靶向功能的信號肽序列，這限制了區室化工程在紅酵母線粒體多基因生物合成途徑中的應用。
2、目前，已在圓紅冬孢酵母細胞質中實現了檸檬烯、1，8-桉葉素、貝殼杉烯和類胡蘿卜素等萜類物質及脂肪醇、脂肪酸等油脂衍生物的生產。同時，r.toruloides?np11作為非傳統酵母，其還具有：(1)作為單細胞微生物，易利用簡單培養基快速生長；(2
技術實現思路
1、為克服現有技術中的不足，本專利技術旨在提供一組線粒體信號肽及其應用，以期在圓紅冬孢酵母線粒體中構建完整的目標產物合成途徑，實現目標產物的生產，促使其對利用紅酵母合成高價值化合物的發展提供潛在的指導。
2、本專利技術所要解決的第一個技術問題是表征一組具有線粒體靶向功能的信號肽。
3、為解決上述問題，本專利技術的技術方案為：
4、1)篩選了一組圓紅冬孢酵母來源的具有潛在靶向線粒體功能的信號肽基因；
5、2)預測了所述一組潛在線粒體信號肽的有效序列；
6、3)克隆融合了線粒體信號肽有效序列的egfp基因；
7、4)將擴增得到的mts-egfp基因分別與表達載體進行連接，獲得重組表達載體；
8、5)將步驟4)得到的重組表達載體導入圓紅冬孢酵母受體菌；
9、6)驗證所述一組線粒體信號肽靶向功能，如mts2、mts3、mts4和mts10等。
10、一組線粒體信號肽(簡稱為mtss)，所述的線粒體信號肽選自如下11條線粒體信號肽序列：所述的11條線粒體信號肽對應的ncbi登錄號為：ems19018.1(mts1)、ems19424.1(mts2)、ems19541.1(mts3)、ems20697.1(mts4)、ems20271.1(mts5)、ems21738.1(mts6)、ems25036.1(mts7)、ems25048.1(mts8)、ems26107.1(mts9)、rhto_07719(mts10)、xp_016275910.1(mts11)。
11、所述的線粒體信號肽的氨基酸序列如seq?id?no.1-11所示。
12、一種所述的線粒體信號肽的基因，所述的線粒體信號肽的基因核苷酸序列gc含量為50-75％。
13、一種包含上述的線粒體信號肽的基因核苷酸序列的重組表達載體。
14、優選地，所述的重組表達載體上至少有一種所述的線粒體信號肽的基因核苷酸序列。
15、優選地，所述的重組表達載體為重組質粒。
16、一種構建過表達線粒體信號肽介導的目標產物合成途徑基因的工程菌，所述的工程菌包含上述的線粒體信號肽的基因核苷酸序列的重組表達載體。
17、優選地，所述的工程菌中包含至少一種所述的重組表達載體。
18、一種線粒體信號肽的應用，單獨或組合使用線粒體信號肽構建包含但不限于檸檬烯、芳樟醇、廣藿香醇、貝殼杉烯、異丁醇及3-羥基丙酸的工程菌，實現線粒體區室化目標產物合成。
19、進一步地，所述的目標產物合成途徑基因的多順反子核苷酸序列通過2a連接肽基因連接，所述的2a連接肽氨基酸序列如seq?id?no.13-14。
20、所述的工程菌為紅酵母菌，所述的紅酵母為rhodotorula屬中的一種，包括但不限于圓紅冬孢酵母r.toruloides、粘紅酵母r.glutinis、膠紅酵母r.mucilaginosa、禾本紅酵母r.graminis、深紅酵母r.rubra、乳糖紅酵母r.lactosa、球型紅酵母r.sphaerocarpum、海洋紅酵母r.marina、瘦果紅酵母r.acheniorum和茂物紅酵母r.bogoriensis。
21、本專利技術要解決的第二個技術問題是提供所述一組線粒體信號肽的應用(以檸檬烯產物為例)。
22、為解決上述問題，本專利技術的技術方案為：
23、1)克隆融合了線粒體信號肽mts2的基因核苷酸序列、且經密碼子優化后的包括但不限于糞腸球菌(enterococcus?faecalis)來源的3-甲基3-羥基戊二酰輔酶a合酶突變體efmvasa110g的基因核苷酸序列；
24、2)克隆了經密碼子優化后的水母來源的增強型綠色熒光蛋白egfp基因；
25、3)克隆融合了線粒體信號肽mts10的基因核苷酸序列、且經密碼子優化后的包括但不限于e.faecalis來源的具有乙酰輔酶a乙酰轉移酶/3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶a還原酶efmvae的基因核苷酸序列；
26、4)克隆了經密碼子優化后的蘑菇珊瑚來源的紅色熒光蛋白rfp基因核苷酸序列；
27、5)克隆融合了線粒體信號肽mts3的基因核苷酸序列、且經密碼子優化后的包括但不限于馬氏甲烷八疊球菌(methanosarcina?mazei)來源的甲羥戊酸激酶mmmk的基因核苷酸序列；
28、6)克隆融合了線粒體信號肽mts4的基因核苷酸序列及包括但不限于紅酵母來源的磷酸甲羥戊酸激酶pmk的基因核苷酸序列；
29、7)克隆融合了線粒體信本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一組線粒體信號肽，其特征在于，所述的線粒體信號肽選自如下11條線粒體信號肽序列：所述的11條線粒體信號肽對應的NCBI登錄號為：EMS19018.1、EMS19424.1、EMS19541.1、EMS20697.1、EMS20271.1、EMS21738.1、EMS25036.1、EMS25048.1、EMS26107.1、RHTO_07719、XP_016275910.1。
2.根據權利要求1所述的一組線粒體信號肽，其特征在于，所述的線粒體信號肽的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1-11所示。
3.一種如權利要求1所述的線粒體信號肽的基因，其特征在于，所述的線粒體信號肽的基因的核苷酸序列GC含量為50-75％。
4.一種包含如權利要求3所述的線粒體信號肽的基因的重組表達載體，其特征在于：所述的重組表達載體上至少有一種所述的線粒體信號肽的基因。
5.根據權利要求4所述的線粒體信號肽的基因的重組表達載體，其特征在于，所述的重組表達載體為重組質粒。
6.一種構建過表達線粒體信號肽介導的目標產物合成途徑基因的工程菌，其特征
7.根據權利要求6所述的構建過表達線粒體信號肽介導的目標產物合成途徑基因的工程菌，其特征在于，所述的工程菌中包含至少一種所述的重組表達載體。
8.根據權利要求7所述的構建過表達線粒體信號肽介導的目標產物合成途徑基因的工程菌，其特征在于，所述的重組表達載體單獨或組合使用線粒體信號肽基因構建包含但不限于檸檬烯、芳樟醇、廣藿香醇、貝殼杉烯、異丁醇及3-羥基丙酸的工程菌，實現線粒體區室化目標產物合成。
9.根據權利要求8所述的構建過表達線粒體信號肽介導的目標產物合成途徑基因的工程菌，其特征在于，在工程菌構建過程中，目標產物合成途徑基因的多順反子核苷酸序列通過2A連接肽基因連接，所述的2A連接肽氨基酸序列如SEQ?ID?NO.13-14。
10.根據權利要求6-9任一項所述的構建過表達線粒體信號肽介導的目標產物合成途徑基因的工程菌，其特征在于，所述的工程菌為紅酵母菌，所述的紅酵母為Rhodotorula屬中的一種，包括但不限于圓紅冬孢酵母R.toruloides、粘紅酵母R.glutinis、膠紅酵母R.mucilaginosa、禾本紅酵母R.graminis、深紅酵母R.rubra、乳糖紅酵母R.lactosa、球型紅酵母R.sphaerocarpum、海洋紅酵母R.marina、瘦果紅酵母R.acheniorum和茂物紅酵母R.bogoriensis。
...【技術特征摘要】
1.一組線粒體信號肽，其特征在于，所述的線粒體信號肽選自如下11條線粒體信號肽序列：所述的11條線粒體信號肽對應的ncbi登錄號為：ems19018.1、ems19424.1、ems19541.1、ems20697.1、ems20271.1、ems21738.1、ems25036.1、ems25048.1、ems26107.1、rhto_07719、xp_016275910.1。
2.根據權利要求1所述的一組線粒體信號肽，其特征在于，所述的線粒體信號肽的氨基酸序列如seq?id?no.1-11所示。
3.一種如權利要求1所述的線粒體信號肽的基因，其特征在于，所述的線粒體信號肽的基因的核苷酸序列gc含量為50-75％。
4.一種包含如權利要求3所述的線粒體信號肽的基因的重組表達載體，其特征在于：所述的重組表達載體上至少有一種所述的線粒體信號肽的基因。
5.根據權利要求4所述的線粒體信號肽的基因的重組表達載體，其特征在于，所述的重組表達載體為重組質粒。
6.一種構建過表達線粒體信號肽介導的目標產物合成途徑基因的工程菌，其特征在于，所述的工程菌包含如權利要求3所述的線粒體信號肽的基因的重組表達載體。
7.根據權利要求6所述的構建過表達線粒體信號肽介導的目標產物...
【專利技術屬性】
技術研發人員：楊曉兵，鄭曉春，王雪，李亞軍，高琦豆，
申請(專利權)人：西北農林科技大學，
類型：發明
國別省市：
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