【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于生物，更具體地，本專利技術(shù)涉及小rna文庫制備過程中去除接頭自連產(chǎn)物的方法。
技術(shù)介紹
1、細(xì)胞異質(zhì)性是由于細(xì)胞與細(xì)胞之間基因的差別、周圍環(huán)境的差別、基因或蛋白的隨機表達(dá)和生物大分子隨機的相互作用等因素導(dǎo)致的細(xì)胞間內(nèi)在的變異(chappellet.al..,2018)。即便是表型相同的細(xì)胞其內(nèi)在分子組成也可能千差萬別。而以往整體測序(bulk-seq)方法忽略了細(xì)胞間的差異，僅僅提供了復(fù)雜細(xì)胞群體一個虛擬的、均一化的“畫像”。隨著研究的深入和細(xì)化，這樣低分辨率的“畫像”在很多方面都已無法滿足需求。而單細(xì)胞測序技術(shù)則不同，它可以獲得每個單細(xì)胞內(nèi)的分子組成，精細(xì)的描繪每一個細(xì)胞獨有的特征。這也就允許專利技術(shù)人去發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的表達(dá)差異、區(qū)分細(xì)胞間的異質(zhì)性、尋找稀有的細(xì)胞類型、在單細(xì)胞尺度上重新構(gòu)建組織或器官的形態(tài)、了解細(xì)胞所處的狀態(tài)、構(gòu)建細(xì)胞的發(fā)育軌跡和進(jìn)行細(xì)胞的譜系追蹤(birnbaum,2018)。自2009年誕生以來，單細(xì)胞rna測序技術(shù)就備受矚目。隨著十年的發(fā)展與成熟，當(dāng)前單細(xì)胞rna測序技術(shù)已被廣泛的應(yīng)用于腫瘤發(fā)生(savas?et.al..,2018；wagner?et.al..,2019；zilionis?et.al..,2019)、胚胎發(fā)育(biaseet.al..,2014；blakeley?et.al..,2015；pijuan-sala?et.al..,2019；xue?et.al..,2013；yan?et.al..,2013)、器官形成(cui?et.al..,2019；gao?et.al..,20
2、相比于單細(xì)胞rna測序方法的日新月異，單細(xì)胞小rna測序方法的發(fā)展則相對遲緩。這主要是因為小rna序列的特殊性導(dǎo)致了它無法像mrna一樣通過簡單的反轉(zhuǎn)錄和擴增來獲取cdna文庫。小rna不具有poly(a)尾巴，無法利用oligo-dt的引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。同時小rna一般比較短，例如mirna長度集中于20-22nt左右，endo-sirna長度集中于20nt左右，稍微長一些的pirna最多也只有30多nt。這么短的序列使用隨機引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄也是不太合適的。因此，當(dāng)前主流的策略都需要先在小rna的兩端連接上接頭序列(接頭)，以便于后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄和擴增(hafner?et.al..,2011)。其大致流程為小rna首先在rna連接酶的作用下與3’端接頭連接，隨后連接上的3’端接頭序列與反轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行互補配對，并與5’端接頭連接。得到的兩端連接了接頭的小rna在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下形成單鏈的cdna，并可進(jìn)行后續(xù)的擴增反應(yīng)以放大這些產(chǎn)物(圖1)。最終得到的產(chǎn)物兩端含有測序通用的序列能夠進(jìn)行高通量測序。
3、這種基于連接反應(yīng)的策略存在著固有的缺陷：體系中3’接頭和5’接頭不可避免的會形成連接副產(chǎn)物(接頭self-ligation)。特別是當(dāng)起始rna過少時，副產(chǎn)物的產(chǎn)生將遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于目的連接產(chǎn)物的形成，導(dǎo)致文庫的質(zhì)量變差，甚至文庫構(gòu)建失敗。這也導(dǎo)致微量rna或單細(xì)胞情形下，小rna文庫構(gòu)建存在著以下幾個難以解決的問題。
4、首先，由于單個細(xì)胞中小rna絕對分子數(shù)少，就要求建庫方法的檢測靈敏度足夠高才能有效的獲得完整的單個細(xì)胞中小rna的信息。以往研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)提升接頭濃度，提升連接反應(yīng)中peg的濃度能有效的增加連接反應(yīng)，提升方法的靈敏度。這些方法對于檢測單個細(xì)胞中種類數(shù)少表達(dá)量較高的mirna是有效的，但對于其中種類數(shù)巨大但豐度很低的一些小rna是否有效并不清楚，例如pirna和endo-sirna等。
5、其次，單個細(xì)胞中小rna的絕對分子數(shù)很少，雖然添加過量的接頭序列后提升了連接反應(yīng)的效率，但由于接頭序列過量，導(dǎo)致連接反應(yīng)中接頭序列沒有足夠的可用的小rna分子與其進(jìn)行連接，從而接頭自我連接產(chǎn)生了數(shù)百倍于目的產(chǎn)物的接頭自連的產(chǎn)物。以往有多種方法來減輕接頭自連的產(chǎn)物，例如cn107488655b使用cas9/sgrna復(fù)合物進(jìn)行接頭自連產(chǎn)物的切除；trilink公司的cleantag技術(shù)使用末端有修飾的接頭以降低接頭的自連效應(yīng)。但任何一種方式都無法完全或者有效的清除接頭自連產(chǎn)物，使得單細(xì)胞小rna文庫構(gòu)建困難，數(shù)據(jù)質(zhì)量堪憂。
6、常用的小rna建庫方法以及常用的建庫試劑盒，其需求的初始rna的量都比較高，一般在100ng細(xì)胞總rna以上，如neb?next?small?rna?library?prep?set，無法滿足微量樣本的小rna測序需求。yang等在2016年發(fā)表了一種微量的小rna建庫方法，最低可以使用10納克細(xì)胞總rna進(jìn)行文庫的構(gòu)建(yang?et.al..,2016)。faridani等建立了第一個單細(xì)胞小rna測序方法small-seq，并研究了初始胚胎干細(xì)胞和活化胚胎干細(xì)胞中小rna的表達(dá)差異(faridani?et.al..,2016)。隨后不久，yang等建立了cas-seq，在單卵子水平研究了人類成熟卵子和早期胚胎中小rna的種類與表達(dá)變化(yang?et.al..,2019)。但以上兩種方法都未能完全解決單細(xì)胞小rna文庫構(gòu)建的中存在的問題，而是分別在靈敏度或數(shù)據(jù)質(zhì)量上做了一定的妥協(xié)。small-seq增加了接頭的濃度以提升連接的效率，增加方法的靈敏度，但同時也增加了連接副產(chǎn)物的產(chǎn)生，使得正式樣品和負(fù)對照在文庫的模式上無法區(qū)分(hagemann-jensen?et.al..,2018)；cas-seq使用了偏低的接頭濃度，并利用cas9特異性切除接頭自連產(chǎn)物，有效的抑制了副產(chǎn)物的形成。但該方法在靈敏度上大打折扣，無法使用單個體細(xì)胞獲得高質(zhì)量的小rna數(shù)據(jù)。
7、因此，如何在保證建庫方法檢測靈敏度的同時，有效的清除接頭自連產(chǎn)物是當(dāng)前單細(xì)胞小rna文庫構(gòu)建的重點問題，極大的限制了微量樣本及單細(xì)胞中小rna的高通量測序，也極大的阻礙了包含小rna在內(nèi)的單細(xì)胞多組學(xué)技術(shù)的發(fā)展。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)的目的在于提供一種小rna文庫制備過程中去除接頭自連產(chǎn)物的方法，包括：步驟a)添加過量反轉(zhuǎn)錄引物(rtp)封閉3’接頭；步驟b)d&l酶處理；和步驟c)cas-sgrna復(fù)合物處理。本專利技術(shù)還提供了小rna文庫制備過程中去除接頭自連產(chǎn)物和污染核酸的方法，小rna文庫制備方法，以及含有小rna文庫的多組學(xué)制備方法等。
2、在本專利技術(shù)的第一方面，提供一種小rna文庫制備過程中去除接頭自連產(chǎn)物的方法，包括：
3、步驟a)添加過量反轉(zhuǎn)錄引物(rtp)封閉3’接頭；
4、步驟b)d&l酶處理；和
5、步驟c)cas-sgrna復(fù)合物處理本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點】
1.一種小RNA文庫制備過程中去除接頭自連產(chǎn)物的方法，包括：
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述小RNA為從細(xì)胞、細(xì)胞上清液、組織、器官、體液或分泌物中提取的RNA；
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步驟a)包括：
4.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步驟b)包括：
5.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步驟c)包括：
6.一種小RNA文庫制備過程中去除接頭自連產(chǎn)物和污染核酸的方法，包括：如權(quán)利要求1～5任一項所述的小RNA文庫制備過程中去除接頭自連產(chǎn)物的方法，以及小RNA文庫制備過程中去除污染核酸的方法；
7.一種小RNA文庫的制備方法，包括：
8.一種試劑盒，包括：
9.一種小RNA文庫，其通過如權(quán)利要求7所述的小RNA文庫的制備方法制備獲得。
10.一種含有小RNA文庫的多組學(xué)測序文庫，其特征在于，所述小RNA文庫通過如權(quán)利要求7所述的小RNA文庫的制備方法制備獲得；
11.如權(quán)利要求1～7任一項所述的方法，
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種小rna文庫制備過程中去除接頭自連產(chǎn)物的方法，包括：
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述小rna為從細(xì)胞、細(xì)胞上清液、組織、器官、體液或分泌物中提取的rna；
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步驟a)包括：
4.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步驟b)包括：
5.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步驟c)包括：
6.一種小rna文庫制備過程中去除接頭自連產(chǎn)物和污染核酸的方法，包括：如權(quán)利要求1～5任一項所述的小rna文庫制備過程中去...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張宏道，劉偉，吳立剛，
申請(專利權(quán))人：中國科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心，
類型：發(fā)明
國別省市：
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