【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物，具體涉及跨膜轉運蛋白在提高微生物赤霉素產量中的應用。
技術介紹
1、水稻、玉米、甘蔗等經濟作物感染禾谷鐮刀菌、藤倉赤霉菌、串珠鐮孢菌等真菌類致病菌后會出現植株瘋長的現象，即“惡苗病”。該病會導致植株瘋長，少結或不結果，甚至使植株脫落或死亡，嚴重危害了我國農業經濟的發展。
2、隨著對惡苗病的深入研究，人們發現造成植物瘋長的主要因素是致病菌分泌的一類植物生長激素—赤霉素(gibberellins，簡稱gas)，赤霉素是一類四環二萜類化合物。與植物瘋狂生長相對應的是，使用ppm水平的赤霉素會帶來消除種子休眠、加速種子萌發、提高作物產量、促進坐果、克服矮化等對植物生長有利的現象。
3、迄今為止，從各類生物里發現的赤霉素已達136種，目前只有屬于自由型的ga1、ga3、ga4和ga7等少數幾種赤霉素具有較強的生理活性。其中ga3的活性最高，應用最廣，是目前唯一商業化大規模生產的赤霉素產品。然而ga3活性過高，過度使用會導致植物瘋長。近年來，ga4+7在保花保果、打破休眠等方面的應用受到關注。但ga4和ga7在作用上存在差異甚至反作用，ga7會強烈抑制花芽的形成，而ga4不僅不會抑制花芽的形成，還具有促進作用，因此，混合使用ga4和ga7可以實現優勢互補。目前市場上常見的混合物劑型有不同比例的ga4和ga7，而富含ga7的劑型市場銷售價格比同含量ga4的劑型高出20％以上。故相較ga3，ga4和ga7更高效、更穩定、更安全，具有更高的經濟價值。
4、然而目前在工業生產中ga4和ga7產
技術實現思路
1、為了解決現有技術中ga4和ga7產量低、生產成本高的問題，本專利技術提供了跨膜轉運蛋白在提高微生物赤霉素產量中的應用，通過過表達npf和sweet家族的轉運蛋白增加赤霉素外排能力，提高ga4和ga7產量。
2、為了實現上述目的，本專利技術的第一方面，提供了跨膜轉運蛋白在提高微生物赤霉素產量中的應用，所述跨膜轉運蛋白選自npf、sweet蛋白家族中的至少一種蛋白。轉運蛋白是一類由脂質雙層組成的非滲透性生物膜，能夠介導包括電化學勢的產生、能量的產生、新陳代謝、信號轉導等過程。擬南芥中存在的npf轉運蛋白屬于大肽轉運蛋白(peptidetransporter，ptr)家族。同時存在的sweet蛋白最初被認為是一類新的糖轉運蛋白，它有助于葡萄糖、果糖和蔗糖等糖的跨膜轉運。
3、具體地，所述微生物包括藤倉赤霉菌。赤霉素的工業生產主要依賴于藤倉赤霉菌(fusariumfujikuroi)的液體發酵。此外，一些屬于鐮刀菌屬的菌種，例如串珠鐮刀菌，以及曲霉屬的菌種，例如黑曲霉，也被證實具有產業化合成赤霉素的潛力。穩定、高產的菌株對工業生產至關重要。
4、具體地，所述赤霉素包括ga4、ga7中的至少一種。結合圖1，藤倉赤霉菌中ga3、ga4、ga7的合成場所在細胞質，其生物合成由tca循環合成的乙酰輔酶a(acetyl-coa)出發，經甲羥戊酸途徑合成異戊烯焦磷酸(ipp)及其異構體二甲烯丙基二磷酸(dmapp)，后續由合成酶催化經由基焦磷酸(gdp)，法尼基焦磷酸(fpp)合成前體二基焦磷酸(ggdp)。在赤霉素合成基因簇的作用下，兩分子ggdp環化合成焦磷酸古巴酯(cdp)后，產生了貝殼杉烯。在c-19上由p450單加氧酶逐步氧化產生貝殼杉烯酸，后續通過在c-7α與c-6β位置的氧化產生ga12-半醛，p450單加氧酶在c-3β與c-7的氧化產生ga14，ga14通過氧化轉化為ga4，經去飽和作用生產ga7，經羥基化轉化為ga3。
5、優選地，所述跨膜轉運蛋白npf選自npf1.2、npf2.5、npf5.5、npf8.1中的至少一種；更優選為npf8.1；
6、所述npf1.2氨基酸序列如seq?id?no.1所示，
7、所述npf2.5氨基酸序列如seq?id?no.2所示，
8、所述npf5.5氨基酸序列如seq?id?no.3所示，
9、所述npf8.1氨基酸序列如seq?id?no.4所示。
10、優選地，所述跨膜轉運蛋白sweet選自sweet1、sweet5中的至少一種；更優選為sweet1；
11、所述sweet1氨基酸序列如seq?id?no.5所示，
12、所述sweet5氨基酸序列如seq?id?no.6所示。
13、具體地，所述應用是將跨膜轉運蛋白通過構建表達質粒的方式在藤倉赤霉菌中異源表達。
14、本專利技術的第二方面，提供了一種高產赤霉素ga4、ga7的藤倉赤霉工程菌，由如下方法構建獲得：將跨膜轉運蛋白npf或sweet基因片段構建至表達質粒，并轉化至藤倉赤霉菌中。
15、本專利技術的第三方面，提供了一種通過跨膜轉運蛋白npf、sweet提高微生物赤霉素產量的方法，包括如下步驟：
16、將跨膜轉運蛋白npf或sweet基因片段構建至表達質粒；
17、將表達質粒轉化進入藤倉赤霉菌原生質體中得到轉化子；
18、制備轉化子種子液，將種子液接種至發酵培養基培養，制備ga4和ga7。
19、具體地，所述跨膜轉運蛋白npf或sweet的基因片段逆轉錄自擬南芥rna。
20、優選地，所述方法包括如下步驟：
21、(1)提取擬南芥rna，逆轉錄得到相應的cdna，并以其為模板pcr得到跨膜轉運蛋白npf或sweet基因片段；線性化載體質粒puc-ffucas9-htbnls-hph后，一步克隆將目的轉運蛋白npf或sweet基因片段與載體連接，構建表達質粒；
22、(2)以野生型藤倉赤霉菌為出發株，收集菌液酶解，制成原生質體懸液；將步驟(1)構建的表達質粒轉化進入原生質體中得到轉化子；
23、(3)將步驟(2)制得的轉化子涂布于在含有潮霉素的myg瓊脂平板上，28℃培養3～5天后，挑選單菌落接種至種子培養基中，28℃、250rpm培養48h，獲得種子液；將種子液接種至發酵培養基，28℃、250rpm培養7天，收集菌液上清，稀釋后測定ga4、ga7的產量。
24、優選地，所述myg培養基組成如下：麥芽糖4～6g/l、酵母提取物4～6g/l、葡萄糖8～12g/l、蔗糖168～173g/l、瓊脂19～21g/l，溶劑為水。
25、優選地，所述種子培養基組成如下：玉米淀粉18～22g/l、蔗糖14～16g/l、花生粉14～16g/l、豆粕2～4g/l、kh2po40.8～1.2g/l，mgso40.8～1.2g/l，溶劑為水。
26、優選地，所述發酵培養基組成如下：玉米淀粉60～90g/l，米粉70～100g/l，豆粕3～7g/l，花生粉3～7g/l，kh2po40.3～0.7g/l，k2so40.3～0.7g/l，mg本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.跨膜轉運蛋白在提高微生物赤霉素產量中的應用，其特征在于，所述跨膜轉運蛋白選自NPF、SWEET蛋白家族中的至少一種蛋白。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述微生物包括藤倉赤霉菌。
3.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述赤霉素包括GA4、GA7中的至少一種。
4.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述跨膜轉運蛋白NPF選自NPF1.2、NPF2.5、NPF5.5、NPF8.1中的至少一種；
5.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述跨膜轉運蛋白SWEET選自SWEET1、SWEET5中的至少一種；
6.根據權利要求1～5任一所述的應用，其特征在于，所述應用包括：將跨膜轉運蛋白通過構建表達質粒的方式在藤倉赤霉菌中異源表達。
7.一種高產赤霉素GA4、GA7的藤倉赤霉工程菌，其特征在于，由如下方法構建獲得：將跨膜轉運蛋白NPF或SWEET基因片段構建至表達質粒，并轉化至藤倉赤霉菌中。
8.一種通過跨膜轉運蛋白NPF、SWEET提高微生物赤霉素產量的方法，其特征在于，包括如
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述跨膜轉運蛋白NPF或SWEET基因片段逆轉錄自擬南芥RNA。
10.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述發酵培養基組成如下：玉米淀粉60～90g/L，米粉70～100g/L，豆粕3～7g/L，花生粉3～7g/L，KH2PO40.3～0.7g/L，K2SO40.3～0.7g/L，MgSO4`7H2O?0.10～0.12g/L，溶劑為水。
...【技術特征摘要】
1.跨膜轉運蛋白在提高微生物赤霉素產量中的應用，其特征在于，所述跨膜轉運蛋白選自npf、sweet蛋白家族中的至少一種蛋白。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述微生物包括藤倉赤霉菌。
3.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述赤霉素包括ga4、ga7中的至少一種。
4.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述跨膜轉運蛋白npf選自npf1.2、npf2.5、npf5.5、npf8.1中的至少一種；
5.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述跨膜轉運蛋白sweet選自sweet1、sweet5中的至少一種；
6.根據權利要求1～5任一所述的應用，其特征在于，所述應用包括：將跨膜轉運蛋白通過構建表達質粒的方式在藤倉赤霉菌中異源表達。
7.一種高產赤霉素ga4、ga7的藤倉赤霉工程菌，其特征在于，由...
【專利技術屬性】
技術研發人員：柳志強，岑宇科，袁家琛，李明涵，薛亞平，鄭裕國，
申請(專利權)人：浙江工業大學，
類型：發明
國別省市：
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