【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及sirna，尤其涉及靶向尿酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白1的sirna及其在降低urat1的表達水平中的應(yīng)用，屬于高尿酸血癥或痛風(fēng)的基因治療領(lǐng)域。
技術(shù)介紹
1、痛風(fēng)是一種常見且可治療的晶體關(guān)節(jié)病，占所有關(guān)節(jié)炎的5％，由尿酸單鈉晶體(msu)沉積在關(guān)節(jié)內(nèi)和關(guān)節(jié)外軟組織和骨骼中非關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)中引起的免疫炎癥。高尿酸血癥及尿酸鹽結(jié)晶、沉積所致的特征性急性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)石、間質(zhì)性腎炎，嚴重者見關(guān)節(jié)畸形及功能障礙，常伴尿酸性尿路結(jié)石。痛風(fēng)患者經(jīng)常同時患上其他疾病。在約75％的病例中，腹部肥胖、高血壓、胰島素抵抗與血脂水平異常構(gòu)成的代謝綜合征與痛風(fēng)同時發(fā)生。痛風(fēng)是紅血球過多癥、鉛中毒、腎衰竭、溶血性貧血、牛皮癬等疾病以及器官移植的常見并發(fā)癥。
2、痛風(fēng)表現(xiàn)為嚴重疼痛性關(guān)節(jié)炎(痛風(fēng)發(fā)作)的間歇性發(fā)作，是一種嘌呤代謝紊亂癥，嘌呤代謝終產(chǎn)物尿酸以單鈉尿酸鹽結(jié)晶，沉淀并在關(guān)節(jié)、肌腱與周圍組織中形成沉淀物(即痛風(fēng)石)。微小的痛風(fēng)石可能被一種環(huán)蛋白質(zhì)清除，這些蛋白質(zhì)可以阻礙晶體和細胞之間的交互作用，從而避免炎癥反應(yīng)的發(fā)生。被蛋白質(zhì)包裹的痛風(fēng)石可能會因微小的關(guān)節(jié)外傷、藥物、手術(shù)應(yīng)激或血尿酸水平的劇烈變化而將裸露的單鈉尿酸鹽晶體釋放。痛風(fēng)石釋放時，會引發(fā)局部免疫介導(dǎo)的炎性反應(yīng)。在臨床實踐和研究中，當血清尿酸鹽高于或等于0.42mmol/l(7mg/dl)時，通常會出現(xiàn)高尿酸血癥(血尿酸鹽濃度超過飽和閾值)，尿酸沉淀形成的誘因尚不完全明確。盡管尿酸可以在血尿酸濃度正常時結(jié)晶，但當血尿酸濃度升高時，尿酸結(jié)晶的可能性更大。引起急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎發(fā)作的其他重要因
3、據(jù)統(tǒng)計，高尿酸血癥大部分(約90％)都是患者腎臟對尿酸鹽清除率下降而造成的，而僅有不到10％的高尿酸血癥病人是因體內(nèi)產(chǎn)生過多的尿酸。腎臟和腸道在尿酸排泄中起著主要作用，超過70％的尿酸排泄發(fā)生在腎臟通道中。因此，開發(fā)用于增加尿酸排泄的試劑具有顯著的治療潛力。血清尿酸鹽受腎臟和腸道中尿酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白的調(diào)節(jié)，特別是glut9(slc2a9)、urat1(slc22a12)和abcg2。尿酸單鈉晶體對nlrp3炎癥小體的激活和il-1β的釋放在痛風(fēng)發(fā)作的開始中起主要作用；聚集的中性粒細胞外陷阱在分辨階段是重要的。盡管痛風(fēng)表現(xiàn)為間歇性發(fā)作，但它是一種慢性疾病。有效治療痛風(fēng)的核心策略是長期降低尿酸鹽治療，以逆轉(zhuǎn)高尿酸血癥，這會導(dǎo)致單鈉尿酸鹽晶體的溶解，并長期預(yù)防痛風(fēng)發(fā)作。目前，除了阻斷黃嘌呤氧化酶(xo)的別嘌醇和非布索坦等藥物外，抑制尿酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白1(urat1)目前是降尿酸治療的主要治療方法。
4、尿酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白1(urat1)是位于人腎近端小管上皮細胞頂膜的膜轉(zhuǎn)運蛋白，由555個氨基酸組成，屬于有機陰離子轉(zhuǎn)運蛋白(oat)家族。urat1在近端腎小管的管腔側(cè)表達，并調(diào)節(jié)尿酸從腎小管向上皮細胞的吸收，介導(dǎo)尿酸鹽的大部分重吸收。因此，靶向通過減少尿酸鹽陰離子的重吸收來改善腎臟尿酸鹽排泄的urat1抑制劑的藥物設(shè)計是目前尋找抗痛風(fēng)藥物的關(guān)鍵。目前批準在臨床環(huán)境中使用的urat1抑制藥物包括丙磺舒、苯溴馬隆、硫吡唑酮和lesinurad。然而，這些藥物有副作用和一定程度的毒性：丙磺舒可引起皮疹、胃腸道刺激、超敏反應(yīng)和溶血性貧血；苯溴馬隆會導(dǎo)致嚴重的肝毒性和骨髓抑制；硫吡唑酮可引起惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉、貧血和皮疹；lesinurad具有劑量依賴性腎毒性，可引起不良心血管事件。在患有嚴重腎功能衰竭、尿酸鹽腎結(jié)石或血液營養(yǎng)不良的患者中，無法使用urat1抑制劑。
5、sirna是一種長約21-25bp的雙鏈rna，帶負電荷，主要通過rna干擾(rnai)實現(xiàn)對目標靶mrna進行高效和高特異性的結(jié)合，并觸發(fā)對靶mrna的特異性降解，從而調(diào)節(jié)基因的表達。篩選有效的sirna可以降低urat1的表達水平，進而治療相關(guān)疾病。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)的目的之一是提供靶向尿酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白1(urat1)的sirna。
2、本專利技術(shù)的目的之二是提供含有所述靶向尿酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白1(urat1)的sirna的重組表達載體。
3、本專利技術(shù)的目的之三是提供含有所述重組表達載體的宿主細胞。
4、本專利技術(shù)的目的之四是將所述的靶向尿酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白1(urat1)的sirna含有所述靶向尿酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白1(urat1)的sirna的重組表達載體應(yīng)用于制備治療高尿酸血癥或痛風(fēng)的基因治療藥物；
5、為實現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)所采取的技術(shù)方案包括：
6、本專利技術(shù)的一方面是提供了靶向尿酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白1(urat1)的sirna，所述sirna由正義鏈以及與所述正義鏈互補的反義鏈所組成的雙鏈rna，所述sirna選自以下(1)-(24)所述雙鏈rna中的任何一種：
7、(1)由核苷酸序列為seq?id?no.1所示的正義鏈和核苷酸序列為seq?id?no.2所示的反義鏈組成的雙鏈rna；
8、(2)由核苷酸序列為seq?id?no.3所示的正義鏈和核苷酸序列為seq?id?no.4所示的反義鏈組成的雙鏈rna；
9、(3)由核苷酸序列為seq?id?no.5所示的正義鏈和核苷酸序列為seq?id?no.6所示的反義鏈組成的雙鏈rna；
10、(4)由核苷酸序列為seq?id?no.7所示的正義鏈和核苷酸序列為seq?id?no.8所示的反義鏈組成的雙鏈rna；
11、(5)由核苷酸序列為seq?id?no.9所示的正義鏈和核苷酸序列為seq?id?no.10所示的反義鏈組成的雙鏈rna；
12、(6)由核苷酸序列為seq?id?no.11所示的正義鏈和核苷酸序列為seq?id?no.12所示的反義鏈組成的雙鏈rna；
13、(7)由核苷酸序列為seq?id?no.13所示的正義鏈和核苷酸序列為seq?id?no.14所示的反義鏈組成的雙鏈rna；
14、(8)由核苷酸序列為seq?id?no.15所示的正義鏈和核苷酸序列為seq?id?no.16所示的反義鏈組成的雙鏈rna；
15、(9)由核苷酸序列為seq?id?no.17所示的正義鏈和核苷酸序列為seq?id?no.18所示的反義鏈組成的雙鏈rna；
16、(10)由核苷酸序列為seq?id?no.19所示的正義鏈和核苷酸序列為seq?id?no.20所示的反義鏈組成的雙鏈rna；
17、(11)由核苷酸序列為seq?id?no.21所示的正義鏈和核苷酸序列為seq?id?no.22所示的反義鏈組成的雙鏈rna；
18、(12)由核苷酸序列為seq?id?no.23所示的正義鏈和核苷酸序本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
1.靶向尿酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白1的siRNA，其特征在于，所述siRNA選自以下(1)-(24)所述雙鏈RNA中的任何一種：
2.一種siRNA，其特征在于，所述siRNA的核苷酸序列含有與權(quán)利要求1所述的siRNA序列中連續(xù)15個及以上核苷酸序列相同的核苷酸序列。
3.一種修飾的siRNA，其特征在于，所述修飾的siRNA是將權(quán)利要求1或2所述的siRNA進行骨架修飾、糖環(huán)修飾和/或堿基修飾中的任何一種修飾后所得到的修飾siRNA；
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的siRNA，其特征在于，所述的siRNA選自以下(1)或(2)中的任何一種：
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的siRNA，其特征在于，所述的修飾的siRNA是采用下述的任何一種的修飾方式對權(quán)利要求1或2所述siRNA的按照以下方式進行修飾得到的修飾siRNA：將所述siRNA的正/反義鏈的3'端非配對的兩個連續(xù)的突出堿基序列TT替換為其它任意兩個核苷或脫氧核苷以及將反義鏈的5′末端進行以下任何一種的磷酸化或磷酸化類似物修飾：
6.一種shRNA或sdRNA，其特征在于，所述shRN
7.表達權(quán)利要求1-5任何一項所述的siRNA的重組表達載體、表達權(quán)利要求6所述shRNA或sdRNA的重組表達載體；優(yōu)選的，所述重組表達載體為真核重組表達載體，更優(yōu)選的，所述真核重組表達載體為重組腺病毒表達載體。
8.含有權(quán)利要求7所述的重組表達載體的重組宿主細胞；優(yōu)選的，所述重組宿主細胞為哺乳動物細胞。
9.權(quán)利要求1-5任何一項所述的siRNA、權(quán)利要求6所述的shRNA或sdRNA、權(quán)利要求7所述的重組表達載體或權(quán)利要求8所述的重組宿主細胞在制備治療高尿酸血癥或痛風(fēng)藥物中的用途。
10.一種治療高尿酸血癥或痛風(fēng)的藥物組合物，其特征在于，由治療上有效量的活性成分和藥物制劑上可接受的載體或輔料組成；其中，所述的活性成分選自權(quán)利要求1-5任何一項所述的siRNA、權(quán)利要求6所述的shRNA或sdRNA、或者是權(quán)利要求7所述的重組表達載體。
...【技術(shù)特征摘要】
1.靶向尿酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白1的sirna，其特征在于，所述sirna選自以下(1)-(24)所述雙鏈rna中的任何一種：
2.一種sirna，其特征在于，所述sirna的核苷酸序列含有與權(quán)利要求1所述的sirna序列中連續(xù)15個及以上核苷酸序列相同的核苷酸序列。
3.一種修飾的sirna，其特征在于，所述修飾的sirna是將權(quán)利要求1或2所述的sirna進行骨架修飾、糖環(huán)修飾和/或堿基修飾中的任何一種修飾后所得到的修飾sirna；
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的sirna，其特征在于，所述的sirna選自以下(1)或(2)中的任何一種：
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的sirna，其特征在于，所述的修飾的sirna是采用下述的任何一種的修飾方式對權(quán)利要求1或2所述sirna的按照以下方式進行修飾得到的修飾sirna：將所述sirna的正/反義鏈的3'端非配對的兩個連續(xù)的突出堿基序列tt替換為其它任意兩個核苷或脫氧核苷以及將反義鏈的5′末端進行以下任何一種的磷酸化或磷酸化類似物修飾：
6.一種shrna或sdrna，其特征在于，所述shrna的核...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：湯新景，經(jīng)男男，
申請(專利權(quán))人：北京大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：
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