【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于生物，具體涉及提高米曲霉曲酸產(chǎn)量的基因aokap10、方法及應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、米曲霉是一種重要生產(chǎn)應(yīng)用價值的絲狀真菌。在醬油、米酒等傳統(tǒng)發(fā)酵食品的生產(chǎn)中米曲霉已被使用了數(shù)百年，被認(rèn)為是gras菌株。由于其具有強(qiáng)大的蛋白生產(chǎn)和分泌能力，因此被用作生產(chǎn)蛋白的宿主。除此之外，米曲霉還可以用來生產(chǎn)一些具有重要應(yīng)用價值的次級代謝物，例如曲酸。
2、曲酸是一種具有多種用途的有機(jī)酸。由于曲酸具有抗菌、抗氧化、抑制酪氨酸酶等生物活性，因此被廣泛用于食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和化妝品等領(lǐng)域。目前曲酸主要是通過米曲霉利用糖類發(fā)酵產(chǎn)生。但從自然界中分離的米曲霉曲酸產(chǎn)量普遍不高，通常需要進(jìn)行誘變篩選高產(chǎn)曲酸菌株。而目前研究表明誘變提高曲酸產(chǎn)量的效果越來越不明顯，因此，相對于傳統(tǒng)誘變提高曲酸產(chǎn)量，利用基因工程遺傳改造米曲霉、提高米曲霉產(chǎn)量是一種更具優(yōu)勢的手段。但利用基因工程遺傳改造米曲霉、提高曲酸產(chǎn)量的前提是明確提高曲酸產(chǎn)量的基因靶點(diǎn)。因此，亟需深入研究曲酸合成調(diào)控機(jī)制，為實(shí)現(xiàn)曲酸高效生物合成提供優(yōu)良的基因靶點(diǎn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、為解決上述技術(shù)問題，本專利技術(shù)提供了提高米曲霉曲酸產(chǎn)量的基因aokap10、方法及應(yīng)用。
2、本專利技術(shù)為實(shí)現(xiàn)技術(shù)目的采用的技術(shù)方案為：
3、第一方面，本專利技術(shù)提供了提高米曲霉曲酸產(chǎn)量的基因aokap10，所述基因aokap10的編碼蛋白具有如下任一種氨基酸序列：
4、a1)如seq?id?no.1所示的氨基酸序列；>
5、a2)將seq?id?no.1所示的氨基酸序列經(jīng)過氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的與a1)所示的蛋白質(zhì)具有75％以上的同一性且具有相同功能的蛋白質(zhì)；
6、a3)在a1)或a2)的n端和/或c端連接標(biāo)簽得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)。
7、本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進(jìn)化或點(diǎn)突變的方法，對本專利技術(shù)的編碼蛋白質(zhì)aokap10的核苷酸序列進(jìn)行突變。那些經(jīng)過人工修飾的，具有與本專利技術(shù)分離得到的蛋白質(zhì)aokap10的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要編碼蛋白質(zhì)aokap10且具有蛋白質(zhì)aokap10功能，均是衍生于本專利技術(shù)的核苷酸序列并且等同于本專利技術(shù)的序列。
8、上述75％或75％以上同一性，可為80％、85％、90％或95％以上的同一性。
9、本專利技術(shù)中，所述80％以上的同一性可為至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
10、為了使中的蛋白質(zhì)便于純化或檢測，可在由序列表中的seq?id?no.1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接標(biāo)簽蛋白。
11、所述標(biāo)簽蛋白包括但不限于：gst(谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶)、his6標(biāo)簽蛋白(組氨酸標(biāo)簽蛋白)、mbp(麥芽糖結(jié)合蛋白)標(biāo)簽蛋白、flag標(biāo)簽蛋白、sumo標(biāo)簽蛋白、ha標(biāo)簽蛋白、myc標(biāo)簽蛋白、egfp(增強(qiáng)型綠色熒光蛋白)、ecfp(增強(qiáng)型青色熒光蛋白)、eyfp(增強(qiáng)型黃色熒光蛋白)或mcherrry(單體紅色熒光蛋白)。
12、第二方面，本專利技術(shù)提供了提高米曲霉曲酸產(chǎn)量的基因aokap10，所述基因aokap10具有如下任一種核苷酸序列：
13、c1)編碼序列是seq?id?no.2的cdna分子；
14、c2)核苷酸序列是seq?id?no.2的dna分子；
15、c3)在seq?id?no.2所示核苷酸序列基礎(chǔ)上經(jīng)密碼子偏好性改造得到的核酸分子；
16、c4)與seq?id?no.2所示的核苷酸序列一致性為95％以上且來源相同種屬的核酸分子。
17、本專利技術(shù)所述的基因aokap10可以為任意能夠編碼上述基因aokap10的編碼蛋白的核苷酸序列?？紤]到密碼子的簡并性以及不同物種密碼子的偏愛性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要使用適合特定物種表達(dá)的密碼子。
18、第三方面，本專利技術(shù)提供了與調(diào)控基因aokap10表達(dá)相關(guān)的生物材料，所述生物材料包括能夠破壞基因aokap10的編碼蛋白的生物學(xué)功能的核酸。
19、其中，調(diào)控基因aokap10表達(dá)相關(guān)的生物材料可為進(jìn)行如下6種調(diào)控中至少一種調(diào)控的物質(zhì)：
20、1)在所述基因轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行的調(diào)控；2)在所述基因轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行的調(diào)控(也就是對所述基因的初級轉(zhuǎn)錄物的剪接或加工進(jìn)行的調(diào)控；3)對所述基因的rna轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)行的調(diào)控(也就是對所述基因的mrna由細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)行的調(diào)控)；4)對所述基因的翻譯進(jìn)行的調(diào)控；5)對所述基因的mrna降解進(jìn)行的調(diào)控；6)對所述基因的翻譯后的調(diào)控(也就是對所述基因翻譯的蛋白質(zhì)的活性進(jìn)行調(diào)控)。
21、進(jìn)一步地，所述調(diào)控基因表達(dá)可為抑制或降低所述基因表達(dá)，所述抑制或降低所述基因表達(dá)可通過基因敲除實(shí)現(xiàn)或通過基因沉默實(shí)現(xiàn)。
22、所述基因敲除(gene?knockout)是指通過同源重組使特定靶基因失活的現(xiàn)象?；蚯贸峭ㄟ^dna序列的改變使特定靶基因失活。
23、所述基因沉默是指在不損傷原有dna的情況下使基因不表達(dá)或低表達(dá)的現(xiàn)象。基因沉默以不改變dna序列為前提，使基因不表達(dá)或低表達(dá)。基因沉默可發(fā)生在兩種水平上，一種是由于dna甲基化、異染色質(zhì)化以及位置效應(yīng)等引起的轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默，另一種是轉(zhuǎn)錄后基因沉默，即在基因轉(zhuǎn)錄后的水平上通過對靶標(biāo)rna進(jìn)行特異性抑制而使基因失活，包括反義rna、共抑制(co-suppression)、基因壓抑(quelling)、rna干擾(rnai)和微小rna(mi?rna)介導(dǎo)的翻譯抑制等。
24、本專利技術(shù)中所述核酸可以是dna，如cdna、基因組dna或重組dna；所述核酸分子也可以是rna，如grna、mrna、sirna、shrna、sgrna、mirna或反義rna。
25、優(yōu)選地，所述核酸包括用于突變基因aokap10的sgrna，所述sgrna的靶序列為如seq?id?no.2所示序列的第198位至第217位。
26、更優(yōu)選地，所述生物材料還包括含有所述核酸的表達(dá)盒、載體、宿主細(xì)胞、工程菌或轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系。
27、本專利技術(shù)中所述載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，包括但不限于：質(zhì)粒、噬菌體(如λ噬菌體或m13絲狀噬菌體等)、黏粒(即柯斯質(zhì)粒)、ti質(zhì)粒、病毒載體等。
28、在本專利技術(shù)的一個實(shí)施例中，所述載體可為pprtii-cas9載體。
29、本專利技術(shù)中所述重組載體具體可為pprtii-cas9-aokap10，重組載體pprtii-cas9-aokap10含有一個編輯靶點(diǎn)(seq?id?no.2的第198-217位)和cas9蛋白的編碼基因，導(dǎo)入受體米曲霉后，轉(zhuǎn)錄的向?qū)na(sgrna)通過堿基互補(bǔ)配對可以靶向受體米曲霉基因組pam附近的本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.提高米曲霉曲酸產(chǎn)量的基因Aokap10，所述基因Aokap10的編碼蛋白為以下任一種：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因Aokap10，其特征在于，所述基因Aokap10具有如下任一種核苷酸序列：
3.與調(diào)控權(quán)利要求1所述的基因Aokap10表達(dá)相關(guān)的生物材料，所述生物材料包括能夠破壞基因Aokap10的編碼蛋白的生物學(xué)功能的核酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生物材料，其特征在于，所述核酸包括用于突變基因Aokap10的sgRNA，所述sgRNA的靶序列為如SEQ?ID?NO.2所示序列的第198位至第217位。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的生物材料，其特征在于，所述生物材料還包括含有所述核酸的表達(dá)盒、載體、宿主細(xì)胞、工程菌或轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系。
6.一種調(diào)控米曲霉曲酸合成或構(gòu)建高產(chǎn)曲酸工程菌株的方法，包括：通過破壞權(quán)利要求1所述基因Aokap10的編碼蛋白的生物學(xué)功能，提高米曲霉曲酸產(chǎn)量。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，利用CRISRP/Cas9技術(shù)破壞所述基因Aokap10的編碼蛋白的生物學(xué)功能，
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，包括如下步驟：
9.權(quán)利要求1所述的基因Aokap10、其編碼蛋白或權(quán)利要求3所述的生物材料在調(diào)控米曲霉曲酸合成或構(gòu)建高產(chǎn)曲酸工程菌中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，通過破壞基因Aokap10的編碼蛋白的生物學(xué)功能，提高米曲霉曲酸產(chǎn)量。
...【技術(shù)特征摘要】
1.提高米曲霉曲酸產(chǎn)量的基因aokap10，所述基因aokap10的編碼蛋白為以下任一種：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因aokap10，其特征在于，所述基因aokap10具有如下任一種核苷酸序列：
3.與調(diào)控權(quán)利要求1所述的基因aokap10表達(dá)相關(guān)的生物材料，所述生物材料包括能夠破壞基因aokap10的編碼蛋白的生物學(xué)功能的核酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的生物材料，其特征在于，所述核酸包括用于突變基因aokap10的sgrna，所述sgrna的靶序列為如seq?id?no.2所示序列的第198位至第217位。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的生物材料，其特征在于，所述生物材料還包括含有所述核酸的表達(dá)盒、載體、宿主細(xì)胞、工程菌或轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系。<...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張哲，邱婷，姚麗華，張煥欣，曾永琦，
申請(專利權(quán))人：江西科技師范大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：
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